山羊支原体肺炎(caprine mycoplasma Pneumoniae,CMP)是由支原体引起山羊的一种以咳嗽、高热、胸膜炎、纤维素肺炎为主要特征的接触性传染病。多种支原体均能引起山羊发生支原体性肺炎,例如山羊支原体山羊肺炎亚种、山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种、丝状支原体丝状亚种LC型以及绵羊肺炎支原体。目前,全世界已有40多个国家和地区曾有过该疾病发生的报道,已经成为严重危害山羊养殖业的重要传染病之一。在国内,山羊支原体肺炎在全国广泛流行,造成我国山羊支原体肺炎的支原体种类有丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、绵羊肺炎支原体等。在四川省,山羊支原体肺炎已经长期存在,但目前还没有关于该病的系统的流行病学调查的报道。PCR技术因具有特异性好,敏感性高,快速的优势,是目前最常用的快速检测方法。但是,检测绵羊肺炎支原体的real-time PCR国内外仍未见报道,可同时检测丝状支原体和绵羊肺炎支原体的双重PCR方法也未见报道,因此开展山羊支原体肺炎的流行病学调查,建立检测丝状支原体和绵羊肺炎支原体的双重PCR方法以及检测绵羊肺炎支原体的real-time PCR方法,对预防和控制该病的具有重要意义。本研究对四川省主要山羊养殖地区山羊支原体肺炎的病原进行系统的流行病学调查,并对快速检测支原体的PCR方法进行了研究,取得如下结果:1四川省主要山羊养殖地区山羊支原体肺炎病原的流行病学调查本研究采用病原分离、PCR鉴定的方法对四川省自贡、简阳、成都、乐山、乐至、南江、眉山7个地区的山羊开展山羊支原体肺炎流行病学调查。通过对培养基的选择及培养条件的优化,从135份临床样本(肺脏和鼻腔棉拭子)中分离出36株支原体,经过PCR鉴定确认为绵羊肺炎支原体,证实四川山羊支原体肺炎的主要病原是绵羊肺炎支原体,主要为单一病原感染,此结果为四川省山羊支原体肺炎的防控提供了科学依据。2成功建立了检测绵羊肺炎支原体real-time PCR方法绵羊肺炎支原体基因序列T/A含量很高,引物设计困难。本研究根据本实验测定的绵羊肺炎支原体分离株swmo15全基因组序列,应用Primer Premier 5.0和Oligo 7.0引物设计软件,选择G/C含量较高的9个靶基因设计21对引物,通引物筛选和反应条件的优化,成功地筛选到一对特异性引物,建立了基于SYBR Green模式检测绵羊肺炎支原体的荧光定量PCR(real-time PCR)方法。结果显示:建立的real-time PCR方法能够扩增出绵羊肺炎支原体146bp大小的片段;该方法线性范围在3×10~3～3×10~7拷贝/反应之间;标准曲线相关系数为0.998;扩增效率为91.3%;标准方程为:y=-3.551x+33.052;最低检测限为3拷贝/反应(0.01pg),灵敏度比已有文献报道的PCR高1000倍;熔解曲线分析显示为单特异峰,无非特异性扩增和引物二聚体,对36株绵羊肺炎支原体菌株的检出率为100%,对丝状支原体山羊亚种(PG3)、丝状支原体丝状亚种LC型(Y-goat)、山羊支原体山羊肺炎亚种(87001)、山羊支原体山羊亚种(SC-2株)、牛支原体(C001)、溶血性曼氏杆菌(NHAU0124)、多杀性巴氏杆菌(cvcc 44502)、金黄色葡萄球菌(SW13)、大肠杆菌(O46)等无关病原检测则无扩增,该方法具有较好的特异性。本研究建立real-time PCR方法为绵羊肺炎支原体病的诊断、流行病学调查及药效评价提供了快速、特异、敏感的新方法。3成功建立了检测绵羊肺炎支原体和丝状支原体簇双重PCR方法采用文献报道的扩增出丝状支原体16S RNA基因548bp的丝状支原体簇通用引物和能扩增出绵羊肺炎支原体16S RNA基因361bp的特异引物,通过对反应条件和反应体系的优化,并对其特异性、灵敏性进行评价,建立了检测绵羊肺炎支原体和丝状支原体簇的双重PCR方法。结果显示:建立的双重PCR对丝状支原体和绵羊肺炎支原体的混合模板最低检测限为10.0pg,与检测绵羊肺炎支原体的单重PCR最低检测限相同,而与检测丝状支原体的单重PCR最低检测限相比则低一个数量级,为1.0 pg。对经过病原分离鉴定为绵羊肺炎支原体和丝状支原体阳性样本的阳性检出率分别为14/36和2/6。本方法一个反应就可以检出绵羊肺炎支原体和丝状支原体,明显缩短了疾病诊断所花费的时间,提高了羊支原体肺炎的诊断效率,适用于山羊支原体肺炎的大规模流行病学调查。
