大豆ERF转录因子GmERF6和GmERF7的克隆与功能鉴定

大豆是重要的粮食和经济作物，不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，同时也是重要的家畜饲料和工业原料。然而病害、干旱、低温和土壤盐渍化等不良环境因子严重影响了大豆的生长发育，给大豆生产造成了巨大损失。研究表明，ERF转录因子在植物应对生物及非生物胁迫反应，调控胁迫相关功能基因的表达，提高植物的抗逆性中起着重要的作用。本研究从大豆（吉林32）中克隆了2个新的ERF转录因子，即GmERF6和GmERF7，并对它们进行结构分析和功能鉴定，研究其调控机制，以期为GmERF6和GmERF7转录因子的进一步应用提供理论基础，并丰富大豆ERF转录因子基因资源。具体实验结果如下:1.采用RT-PCR方法从大豆品种吉林32中分离出两个新的ERF转录因子基因。GmERF6的ORF全长582bp，编码260个氨基酸，包含一个AP2/ERF结合域，两个预测的核定位信号和一个EAR抑制元件，预测其在细胞核中起转录抑制作用；GmERF7的ORF全长1179bp，编码392个氨基酸，包含一个AP2/ERF结合域，两个预测的核定位信号，一个预测的转录激活域和一个MCGGAI(I/L)元件，预测其在细胞核中起转录激活作用。氨基酸序列比对和进化树分析结果表明：GmERF6被划分到ERF转录因子亚家族的第II亚类，与大豆中的GmERF4的亲缘关系最近，推测它们可能存在共同的起源；GmERF7被划分到ERF转录因子亚家族的第IV亚类，与大豆中的GmERF3的亲缘关系最近，推测它们可能存在共同的起源。2.分别构建了GmERF6和GmERF7的绿色荧光蛋白融合表达载体，利用农杆菌介导的洋葱表皮细胞遗传转化进行亚细胞定位。证明GmERF6蛋白和GmERF7蛋白均定位于细胞核中。3.将GmERF6和GmERF7在酵母系统中的表达。结果表明，GmERF6在酵母中不具有转录激活功能，而GmERF7具转录激活功能，属于转录激活子。4.将GmERF6和GmERF7在原核系统中表达，对重组蛋白纯化后进行凝胶阻滞分析。结果表明，GmERF6蛋白和GmERF7蛋白在体外均可以与GCC-box元件特异结合。5.在烟草叶片中对GmERF6和GmERF7的转录调节活性进行瞬时表达分析。结果表明，GmERF6在体内具有转录抑制活性，不仅可以抑制下游目的基因的表达，还可以抑制其他转录激活子的激活活性；GmERF7在体内具有转录激活活性，可以激活下游基因的表达。6.利用实时荧光定量PCR对GmERF6和GmERF7基因的组织表达特性和逆境诱导表达特性进行分析。结果表明，GmERF6和GmERF7在各组织中均有表达，不具有组织特异表达性，但它们在根部表达量明显高于其他组织。GmERF6和GmERF7对干旱、高盐、低温、机械伤害、ABA、ET、SA和MeJA八种生物及非生物胁迫处理均存在不同程度的应答响应。7.通过PCR分别从大豆吉林32的DNA中扩增得到1986bp的GmERF6启动子序列（GmERF6P）和1963bp的GmERF7启动子序列（GmERF7P），并发现它们含有多种与逆境相关的顺式作用元件。将GmERF6P和GmERF7P在烟草叶片中进行瞬时表达。结果表明，GmERF6P和GmERF7P具有较弱的启动活性。干旱、高盐、低温、ET、GA和ABA处理10h诱导GmERF6P的启动活性不同程度的增强；干旱、高盐、ET和GA处理10h诱导GmERF7P的启动活性不同程度的增强，但低温和ABA处理10h降低了GmERF7P的启动活性。将GmERF6P与GmERF6基因共同转化烟草叶片进行瞬时表达后GmERF6P的启动活性被抑制，证明GmERF6基因的表达存在着反馈抑制作用。8.将GmERF6构建到植物表达载体pBI121上转化拟南芥。利用半定量RT-PCR方法对T3代GmERF6转基因拟南芥中的抗逆相关基因的表达情况进行检测。结果表明，在转基因拟南芥中，AtKin1、AtSOS1、AtPR3、AtRD22、AtERF4、AtERF7和AtNIMIN1的表达量明显下降，AtPDF1.2和AtPR4的表达量明显上升。干旱胁迫下GmERF6转因拟南芥种子萌发率显著高于野生型种子萌发率；断水处理18d后GmERF6转基因拟南芥长势好于野生型拟南芥；GmERF6转基因拟南芥离体的脱水率低于野生型拟南芥离体的脱水率。以上结果表明，GmERF6提高了转基因拟南芥的抗旱能力。9.将GmERF7构建到植物表达载体pBI121上转化拟南芥和烟草。利用半定量RT-PCR方法对T3代GmERF7转基因拟南芥中的抗逆相关基因的表达情况进行检测。结果表明，在转基因拟南芥中，AtKin1和AtRD29A的表达量明显升高。高盐胁迫下GmERF7转因拟南芥种子萌发率显著高于野生型种子萌发率。高盐胁迫下GmERF7转基因烟草长势好于野生型烟草；GmERF7转基因烟草植株在高盐胁迫下可维持较高的叶绿素含量，降低丙二醛的积累并提高可溶性糖的积累。以上结果表明，GmERF7提高了转基因拟南芥和烟草的抗盐能力。