转基因法夫酵母高产3S,3S虾青素的研究

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虾青素(astaxanthin)作为含氧酮基类胡萝卜素具有强抗氧化性,能够清除体内自由基。延缓衰老,对人类的健康非常有益。同时虾青素是一种呈红色的色素,主要在海洋生物体内积累,有助于提高养殖鱼类的色泽,具有巨大的经济价值。法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)以其生长速度快,类胡萝卜素及虾青素产量高成为天然虾青素生产的研究热点。但是法夫酵母是自然界内唯一产生3R, 3’R虾青素的生物,这种虾青素独特的构型给它的生物利用带来了障碍。在本文中,首次实现了将外源的β-胡萝卜素酮基酶和β-胡萝卜素羟化酶基因转入法夫酵母产β-胡萝卜素突变株内,在转化子内积累了3S, 3’S构型的虾青素。利用实验室保存的来源于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的β-胡萝卜素酮基酶(β-carotene ketolase)bkt和来源于欧文氏细菌的β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase)crtZ基因构建了一系列法夫酵母表达载体: pPRcDNA1-bkt , pPR2TNH-bkt , pPRcDNA1-crtZ和pPRCDNA1crtZ-bkt ,pPR2TNHasy应用于后续的法夫酵母转化工作。利用pPR2TNHasy转化法夫酵母突变体,探索了法夫酵母的最适转化条件:在电压5KV/cm ,以50 mmol/ L浓度的DTT处理处于对数生长期的法夫酵母细胞,质粒浓度控制在0.7μg/μL的条件下,法夫酵母的转化效率达到最高,为2.9×103转化子/4μg DNA。将来源于雨生红球藻的β-胡萝卜素酮基酶(β-carotene ketolase)和来源于欧文氏菌属的β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase)通过电击转化分别整合到法夫酵母(X. dendrorhous)突变体CBS6938 pr-1-104的核糖体DNA上,成功得到了有目的产物角黄质(canxanthin)和玉米黄质(zeaxanthin)法夫酵母转化子。利用抗生素梯度平板筛选,法夫酵母产孢子实验以及抗生素梯度平板筛选结合薄层层析等方法筛选出高产目的产物的酵母转化子;通过培养基碳。源氮源优化等方法,使得转入酮基酶基因的法夫酵母中角黄质(canxanthin)水平有大幅提高,达到了总类胡萝卜素含量为420μg/g干菌体,角黄质占总类胡萝卜素含量的45%,带有酮基集团的类胡萝卜素占总类胡萝卜素的58%;对于转入crtZ基因产玉米黄素的法夫酵母转化子玉米黄素(zeaxanthin)水平有大幅提高,达到了总类胡萝卜素含量为402μg/g干菌体,玉米黄素占总类胡萝卜素含量的45%,带有羟基集团的类胡萝卜素占总类胡萝卜素的70%。为了获得稳定高产虾青素的转基因法夫酵母,将β-胡萝卜素酮基酶(β-carotene ketolase)和β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase)共同转化整合到法夫酵母突变体CBS6938 pr-1-104的核糖体DNA上,成功得到了有目的产物虾青素的法夫酵母转化子,首次证明了外源基因β-胡萝卜素酮基酶(β-carotene ketolase)和β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase)可以在法夫酵母中以β-胡萝卜素(β-carotene)为底物合成虾青素。利用高抗生素浓度平板筛选,得到高产虾青素的法夫酵母转化子;通过培养基优化,使得目的产物水平有大幅提高,通入8L/h的空气和提供600LUX的光照,使得总类胡萝卜素产量达到580μg/g干菌体,同时虾青素的含量占到了17.22%。
中文摘要第3-5页
ABSTRACT第5-6页
第一章 文献综述第10-34页
    1.1 类胡萝卜素第10-14页
        1.1.1 类胡萝卜素的结构第10页
        1.1.2 类胡萝卜素的功能第10-14页
    1.2 虾青素第14-20页
        1.2.1 虾青素的性质、应用及经济价值第14-16页
        1.2.2 虾青素的生产第16-20页
        1.2.3 天然虾青素与人工合成虾青素的对比第20页
    1.3 法夫酵母第20-26页
        1.3.1 法夫酵母的生物学特征第20-22页
        1.3.2 红法夫酵母虾青素生物合成途径、相关酶及分子生物学研究第22-26页
    1.4 法夫酵母发酵生产虾青素研究现状第26-32页
        1.4.1 高产虾青素法夫酵母菌株的选育与菌种改良第26-29页
        1.4.2 红法夫酵母发酵条件研究第29-32页
    1.5 本研究的目的意义、研究内容与技术路线第32-34页
        1.5.1 研究的目的意义第32页
        1.5.2 研究内容第32-33页
        1.5.3 技术路线第33-34页
第二章 材料与方法第34-45页
    2.1 实验材料与设备第34-37页
        2.1.1 质粒和菌株第34页
        2.1.2 主要实验仪器第34-35页
        2.1.3 实验所用培养基第35-36页
        2.1.4 实验所用主要试剂第36-37页
    2.2 实验方法第37-45页
        2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2 法)第37页
        2.2.2 质粒热击转化大肠杆菌第37页
        2.2.3 质粒电击转化大肠杆菌第37-38页
        2.2.4 质粒DNA 的小量提取第38页
        2.2.5 质粒DNA 的大量提取第38-39页
        2.2.6 DNA 的琼脂糖凝胶电泳第39页
        2.2.7 琼脂糖凝胶DNA 回收第39页
        2.2.8 PCR 扩增反应第39-40页
        2.2.9 PCR 产物纯化第40页
        2.2.10 DNA 的限制酶消化第40-41页
        2.2.11 DNA 的连接反应第41页
        2.2.12 法夫酵母基因组DNA 的快速分离第41-42页
        2.2.13 法夫酵母转化方法第42页
        2.2.14 酵母生长曲线的测定第42-43页
        2.2.15 酵母类胡萝卜素的提取第43页
        2.2.16 类胡萝卜素含量的测定方法第43页
        2.2.17 酵母类胡萝卜素的HPLC 检测第43-44页
        2.2.18 薄层层析法分离检测玉米黄素第44-45页
第三章 法夫酵母表达载体构建第45-59页
    3.1 构建法夫酵母(X. dendrorhous)表达载体的材料第45页
    3.2 法夫酵母(X. dendrorhous)表达载体的构建第45-58页
        3.2.1 法夫酵母表达载体 pPRcDNA1bkt 的构建第45-47页
        3.2.2 法夫酵母表达载体pPR2TNHbkt 的构建第47-49页
        3.2.3 法夫酵母表达载体pPRcDNA1crtZ 的构建第49-52页
        3.2.4 法夫酵母表达载体pPR2TNHasy 的构建第52-55页
        3.2.5 法夫酵母表达载体pPRcDNA1crtZ-bkt 的构建第55-58页
    3.3 小结第58-59页
第四章 法夫酵母电击转化方法的优化第59-65页
    4.1 法夫酵母电击转化方法所使用的材料第59页
    4.2 法夫酵母电击转化方法的优化第59-64页
        4.2.1 法夫酵母表达载体pPR2TNHasy 质粒DNA 的验证和准备第59-61页
        4.2.2 影响法夫酵母电击转化的几个重要参数优化第61-64页
    4.3 小结第64-65页
第五章 单基因转化法夫酵母产物分析及发酵条件优化第65-87页
    5.1 pPRcDNA1bkt,pPR2TNHbkt 和 pPRcDNA1crtZ 转化法夫酵母 pr-1-104 突变株及其产物分析第65-75页
        5.1.1 pPRcDNA1bkt 转化法夫酵母及其产物分析第65-69页
        5.1.2 pPR2TNHbkt 转化法夫酵母及其产物分析第69-72页
        5.1.3 pPRcDNA1crtZ 转化法夫酵母及其产物分析第72-75页
    5.2 pPR2TNHbkt 和pPRcDNA1crtZ 转化法夫酵母pr-1-104 转化子的产物优化第75-81页
        5.2.1 pPR2TNHbkt 转基因法夫酵母产物优化第75-79页
        5.2.2 pPRcDNA1crtZ 转基因法夫酵母产物优化第79-81页
    5.3 pPR2TNHbkt 和pPRcDNA1crtZ 转化法夫酵母pr-1-104 转化子的培养基优化第81-85页
        5.3.1 pPR2TNHbkt 和pPRcDNA1crtZ 转化法夫酵母pr-1-104 转化子的碳源优化第81-83页
        5.3.2 pPR2TNHbkt 和pPRcDNA1crtZ 转化法夫酵母pr-1-104 转化子的氮源优化第83-85页
    5.4 小结第85-87页
第六章 多基因转化法夫酵母产物分析及发酵条件优化第87-103页
    6.1 双基因共转化法夫酵母突变体 CBS6938 pr-1-104第87-98页
        6.1.1 crtz 转化高产角黄质法夫酵母菌株第87-90页
        6.1.2 bkt 转化高产玉米黄质的法夫酵母菌株第90-93页
        6.1.3.pPRcDNA1crtZ+bkt 转化法夫酵母β-胡萝卜素突变株第93-96页
        6.1.4. 抗生素压力筛选提高转化虾青素含量第96-98页
    6.2 优化培养条件对于法夫酵母双基因转化子的影响第98-101页
        6.2.1 培养基优化对于法夫酵母双基因转化子的影响第98-100页
        6.2.2 培养条件优化第100-101页
    6.3 小结第101-103页
第七章 讨论与展望第103-108页
    7.1 全文结论与讨论第103-106页
    7.2 法夫酵母虾青素生产研究展望第106-108页
参考文献第108-118页
发表论文和科研情况说明第118-119页
致谢第119页
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