免疫炎症偶联内质网应激参与心衰的发病机制及免疫球蛋白的干预作用

心力衰竭时伴随以细胞因子水平升高为标志的免疫炎症系统异常激活，炎性细胞因子能通过抑制心肌收缩力、促心肌细胞肥大、凋亡及参与细胞外的基质代谢等途径启动并加重了心衰。细胞因子能通过正反馈机制来增加自身的合成，故细胞因子持续激活将导致心衰的不断进展。TNF-、IL-6是心衰免疫机制中起关键作用的细胞因子，其能否和BNP一样用于心衰的诊断、心功能评价、病情监控或预后判断或成为心衰治疗的靶点是目前研究的热点。在心衰的治疗上，尽管针对免疫炎症致病作用和其引发的反应及机制进行了大量研究，并提出了许多拮抗措施，但心衰的发生率和死亡率却无明显降低，所以选取一个有效的靶点成为心衰免疫治疗的关键所在。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)能纠正错误折叠的蛋白质，增强细胞适应和抵抗应激的能力，但如果应激过强或持续时间过久，ERS将激活相应的信号转导途径导致细胞损伤，从而参与免疫炎症反应。ERS能诱导NF-B活化，从而介导免疫炎症；又能诱导NF-B抑制因子A20的表达来抑制NF-B的活性，导致炎性细胞因子的表达降低，使细胞处于免疫失能状态。炎性细胞因子由ROS介导能引起ERS，ROS又促进了炎症反应。因此内质网应激-免疫炎症反应在特定的细胞内偶联参与心衰的发生、发展，然而免疫炎症的激活与内质网应激反应在心衰中的关系研究及对心衰的影响国内外鲜有报道。免疫球蛋白(IVIG)是具有免疫替代和免疫调节活性的蛋白质，通过炎症反应-内质网应激通路，对单核－巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞的增殖、趋化和炎症介质释放及NF-B转录活性等多方面进行调节，在免疫炎症性疾病中发挥特异性抗炎作用。然而，免疫球蛋白如何调节炎症反应-内质网应激反应，从而控制心衰还没有确切的阐述。本试验观察心衰时细胞因子的表达与心功能之间的相关性以及它们与ERS的关系，在临床、整体及分子水平分析细胞因子在心衰发生及发展中的意义及免疫炎症与ERS偶联致心衰的可能分子机制，并通过观察免疫球蛋白干预后上述关系的变化，揭示免疫球蛋白治疗心衰的免疫调节作用及其可能机制，为临床应用免疫球蛋白提供试验依据。方法:心衰病人根据心功能分为NYHA II、NYHA III和NYHA IV组，并以同期健康者做对照，ELISA方法检测血清中TNF-、IL-6及BNP水平。结扎雌性Wistar大鼠左冠状动脉前降支建立心梗后心衰动物模型，并设假手术组做对照，术后4周随机分为模型组和免疫球蛋白组，分别给予生理盐水及IVIG腹腔注射治疗4周，测定血流动力学参数；观察心脏大体形态，HE和Masson染色观察心肌细胞形态学和胶原纤维增生情况；测定血清中TNF-、IL-6表达水平；RT-PCR检测心肌组织TNF-、IL-6mRNA水平；免疫组化法检测TNF-、IL-6在组织中表达，TUNEL染色法心肌细胞凋亡水平；取胸腺及脾测定淋巴细胞增殖能力及其分泌TNF-、IL-6能力；Western blot检测TNF-、IL-6及GRP78蛋白表达。结果：心衰病人血清中IL-6、TNF-、BNP水平较对照组明显升高与心功能分级呈正相关；进一步分析显示心衰病人血清中的IL-6、TNF-水平与BNP水平呈正相关。与假手术组比较，模型组大鼠LVSP、±dp/dtmax均明显下降，LVEDP明显增加，全心肥厚指数(HW/BW)及左心肥厚指数(LVHW/BW)明显增高；IVIG干预后LVSP、±dp/dtmax明显升高，LVEDP降低；HW/BW及LVHW/BW显著降低。形态学检测结果显示：模型组大鼠心脏体积增大，几何形状改变，心室腔扩大，有室壁瘤形成。HE染色模型组心肌细胞排列紊乱，呈不同程度变性及肥大。免疫球蛋白组大鼠心脏体积增大较模型组减轻，基本能保持正常几何形状；室壁瘤形成较少，心室腔扩张情况较模型组减轻。HE染色显示IVIG处理组大鼠心肌细胞肿胀较模型组明显减轻。Masson染色显示模型组大鼠心肌细胞肥大，数量减少，排列紊乱，间隙可见大量绿色胶原纤维；而免疫球蛋白组能明显降低心肌纤维化程度。模型组大鼠血清TNF-、IL-6、BNP较假手术组明显升高，且TNF-、IL-6与血清BNP水平呈正相关，IVIG干预后显著下降；模型组大鼠心肌组织TNF-、IL-6mRNA含量较假手术组增高，IVIG干预后显著下降。TUNEL染色法显示：模型组细胞凋亡明显，IVIG干预能抑制心肌细胞凋亡。淋巴细胞转化试验结果显示，模型组淋巴刺激指数明显高于假手术组。同时淋巴细胞培养上清中TNF-、IL-6水平较假手术组明显升高。IVIG组淋巴细胞增殖能力与模型组相比显著降低，细胞培养上清中TNF-α、IL-6水平显著减低。模型组心肌组织内质网应激反应标志性蛋白GRP78及TNF-α、IL-6蛋白表达升高，应用IVIG干预治疗明显可下调GRP78及TNF-、IL-6蛋白表达水平。结论：1.心衰时免疫系统激活，表现为TNF-α、IL-6等炎性细胞因子在血清、蛋白及基因表达水平均明显升高，并与心功能分级及血清BNP水平呈正相关。2.免疫球蛋白可以降低TNF-α、IL-6表达水平，改善心衰大鼠的心功能，提示免疫球蛋白改善心功能的可能机制是抑制免疫系统的异常激活。3．心梗后心衰大鼠出现心脏肥大，心肌纤维增生，心肌细胞凋亡。免疫球蛋白可以稳定心脏正常结构，抑制心肌纤维增生及心肌细胞凋亡，保护心脏结构与功能。4.心梗后心衰大鼠T、B淋巴细胞增殖、分化能力增强及T、B亚群活化，提示心衰时免疫系统被激活；心衰时内质网应激的标志性蛋白GRP78表达增加，与炎性细胞因子TNF-α、IL-6在心衰大鼠心肌组织表达相一致，提示免疫炎症与内质网应激偶联共同参与了心衰的发展。5.免疫球蛋白能抑制GRP78及TNF-α、IL-6蛋白高表达，提示免疫球蛋白改善心功能的可能机制是通过抑制内质网应激反应从而抑制免疫系统激活实现的。