色盐杆菌ST307甜菜碱合成酶基因的克隆与功能分析

色盐杆菌ST307是本实验室分离的盐地碱蓬内生中度嗜盐菌，中度嗜盐菌是一类在0.5mol/L(约3%)到2.5mol/L(约15%)NaCl浓度之间有最佳生长的细菌，广泛存在于盐湖、盐场、沙漠、高盐土壤和盐渍食物等各种环境。中度嗜盐菌不同于嗜盐古菌，其耐盐机制主要是细胞内积累相容性物质，如甘氨酸甜菜碱，来抵抗外界高渗透压从而达到平衡。甘氨酸甜菜碱简称甜菜碱，在细菌中由胆碱脱氢酶（betA）和甜菜碱醛脱氢酶（betB）负责其合成。目前甜菜碱及其盐酸盐在化工、医药、及工业等方面的用途非常广泛，并且合成甜菜碱的酶在植物基因工程方面有很好的应用前景。前期研究发现色盐杆菌ST307属于色盐杆菌属中的新类群，且在0.8M NaCl浓度下有最适生长，其耐盐机理以及甜菜碱合成酶基因研究具有重要意义。本文首先考察了盐地碱蓬内生中度嗜盐菌色盐杆菌ST307不同阴阳离子对其生长的影响，接着对菌株ST307体内甜菜碱积累的情况进行分析，最后着重对甜菜碱合成酶基因betA和betB进行了克隆与表达分析。具体实验结果如下：1.在实验考查的各种阴阳离子中，其中阳离子有Na+、NH4+、Li+、K+、Ca2+、阴离子有Cl-、SO42-、I-、Br-、NO3-。当培养基中的Na+离子（0.8M）用等摩尔的NH4+、Li+、K+、Ca2+替代后，结果菌株ST307均不生长，说明色盐杆菌ST307的生长离不开Na+。当培养基中Cl-离子（0.8M）用等摩尔的SO42-、I-、Br-、NO3-替代后，菌株ST307均有不同程度的生长，其中SO42-离子长势尤为好，说明Cl-为菌株ST307生长非必需离子。进一步考察色盐杆菌ST307在一系列盐浓度含不同阴阳离子化合物的培养基上生长，结果阳离子中NH4+对其生长具有促进作用，并且在有NH4+存在的培养基中该菌株对其Na+的需求量降低，而Ca2+离子对其菌株表现为抑制作用。Li+、K+离子非生长所需。阴离子中SO42-离子对其生长具有促进作用，NO3-、Br-是随着培养基中NO3-、Br-离子浓度逐渐升高而该菌株菌体生长量却在减少，说明NO3-、Br-对其生长具有抑制作用，在含有I-离子的培养基中，色盐杆菌ST307均不生长，说明I-离子具有很强的抑制作用。2.对盐地碱蓬内生中度嗜盐菌色盐杆菌ST307采用醇提法提取甜菜碱，紫外分光光度法进行光谱扫描，检测发现色盐杆菌ST307细胞中积累甜菜碱。同时从3%、5%、7%、9%等系列盐浓度下对色盐杆菌ST307细胞中的甜菜碱进行提取并检测，检测数据显示随着盐浓度的升高甜菜碱的积累量也随之增加，当培养基中盐浓度从3%增加到9%时，甜菜碱的积累量增加幅度为20%。说明盐地碱蓬内生中度嗜盐菌色盐杆菌ST307中耐盐机制之一为体内积累甜菜碱。3.根据甜菜碱醛脱氢酶基因的保守区设计一对简并引物，以盐地碱蓬内生中度嗜盐菌色盐杆菌ST307总DNA为模板扩增获得色盐杆菌ST307 betB基因的保守区序列，再通过分段克隆法获得基因5’及3’端的非保守的未知区域，经过序列拼接最后得到色盐杆菌ST307 betB基因的完整编码区。结果显示，该基因共1470核苷酸，编码489个氨基酸。通过BLAST序列分析，该基因序列和多个GenBank数据库中的核苷酸序列同源性较高，最高能达到79%。蛋白序列比对及进化树构建结果显示，色盐杆菌ST307其BADH序列与Chromohalobactersalexigens DSM3043和Halomonas elongata DSM2581的进化关系最近，且具有BADH保守的与NAD+结合的(Asn170,Glu250,and Cys290)和与酶的作用底物结合的活性位点。4.将克隆的甜菜碱醛脱氢酶全基因连到表达载体pET-27b上，通过测量菌体生长量来检测表达效果，发现在加入IPTG诱导表达后，菌体生长量在不同盐度下均有所增加，其中增加幅度最高为36%。说明盐地碱蓬内生中度嗜盐菌色盐杆菌ST307的BADH合成酶基因的导入提高了大肠杆菌的耐盐性，进一步验证了本实验克隆的色盐杆菌ST307的甜菜碱醛脱氢酶基因具有渗透调节功能。