近年来,血栓性疾病的发病率和死亡率居高不下,已成为严重威胁人类健康的心血管系统疾病。针对血栓病的治疗最有效和常规的方法是通过口服或注射纤溶剂来溶解血栓中的主要蛋白成分-纤维蛋白,从而引起血栓的溶解。现有溶栓剂存在价格昂贵、出血风险高、半衰期短、副作用大等问题,亟需开发新的溶栓药物来克服这些问题。本研究以我国传统大豆发酵食品-豆豉为研究对象,对豆豉纤溶酶产生菌的分离鉴定及液体发酵条件优化、豆豉纤溶酶提取纯化及基础生化特性研究、豆豉纤溶酶体内外抗栓效果评价等内容进行研究,目的在于从豆豉中分离出纤溶酶产生菌,提取并纯化耐热、耐酸碱、比活性高、特异性高、出血风险小、安全价廉的纤溶酶,为其开发成为新一代溶栓药物提供科学依据。第一部分豆豉纤溶酶产生菌的分离鉴定及液体发酵条件的优化目的：从不同豆豉样品中分离出产纤溶酶的菌株,并筛选出产量最高的一株,鉴定其种属。对其优化发酵条件和培养基成分,以获得最高产酶量。方法：以纤维蛋白平板法初步筛选出产纤溶酶的细菌,再定量测定其发酵液的酶活性,选择酶活性最大的一株菌进行研究。对该菌株进行生理生化及16SrDNA序列研究,确定种属。以单因素实验方法筛选出该菌株液体发酵产酶所需的最佳条件(温度、初始pH、接种量、装液量)和最佳碳、氮源。根据Plackett-Burman设计确定影响产酶的关键培养基成分,再采用响应面法优化各关键成分的比例。最后根据优化结果拟合出多元回归方程,计算最佳培养基组成。按优化出的发酵条件和培养基,绘制该菌株的生长和产酶曲线。结果：筛选到8株产溶栓酶菌株,命名产酶活性最高的一株菌为XY-1,该菌所产纤溶酶命名为豆豉纤溶酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme, DFE)。经生理生化试验及16SrDNA序列鉴定,确定XY-1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。最佳发酵条件为：温度40℃、装液量50ml/250ml、接种量4%、初始pH8.0。最佳碳、氮源为蔗糖和蛋白胨。培养基的最佳组成为：蛋白胨1.14%,蔗糖0.5%,MgSO40.05%, NaCl0.1%。DFE产量的实际最大值达到了21.33FU/ml,相当于最大预测值的107.84%,与未优化的培养基相比,增加了79.55%。细胞外酶活性远大于胞内酶活。该菌的生长迟缓期很短,不到4小时,然后进入对数生长期,16小时后,细菌生长进入稳定期。DFE的产量随着细菌数量的增多而增加,在24小时左右时达到最大值。结论：从豆豉中分离到产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌XY-1(Bacillus amyloliquefaciens),其培养基的最佳组成为：蛋白胨1.14%,蔗糖0.5%,MgSO40.05%, NaCl0.1%,最佳发酵条件为：温度40℃、装液量50ml/250ml,接种量4%、初始pH8.0。DFE的产量在24小时左右时达到最大值。第二部分豆豉纤溶酶的提取、纯化及基础生化特性研究目的：探讨从菌株XY-1的发酵液中提取、纯化DFE的方法和条件,并在获得纯品DFE的基础上,研究该酶的生化特点。方法：发酵液经过硫酸铵分段盐析、透析脱盐后,上SP sepharose fast flow阳离子层析柱提取纯化,并计算在此过程中酶活性和蛋白含量的变化。比较不同pH和温度对酶反应活性的影响,以及不同pH、温度、金属离子和化学抑制剂对DFE稳定性的影响。比较DFE在含有或不含纤溶酶原平板上的溶圈差异,鉴别其纤溶方式。根据Lineweaver-Burk法,以纤维蛋白作为底物,测定DFE的K氏反应常数Km和Vmax。将DFE纯品处理后,经HPLC-MS/MS检测,并将碎片结构与NCBI中非冗余蛋白质数据库的质谱信息进行比对,鉴定DFE类别。结果：纯化的DFE经SDS-PAGE鉴定仅有一条带,达到电泳纯,分子量为27000Da。DFE被纯化了24.3倍,回收率为19.9%,比酶活为2647.3FU/mg。最佳反应pH为9.0,在pH7.0～10.0范围内相当稳定。DFE在40℃时活性最强,在40℃以下时活性较稳定。Ba2+和Co2+对DFE活性有明显促进作用,而Pb2+,Fe3+和Hg+会显著抑制DFE活性,Ca2+和Cu2+轻微抑制其活性。Na+,K+和Mg2+并未表现出对DFE有明显的抑制或促进作用。EDTA和PMSF完全抑制该酶活性,而β-巯基乙醇对其几乎无影响。DFE可以直接降解纤维蛋白,而不需要先激活纤溶酶原。Km值为6.98e-08mmol, Vmax为232.5FU。该酶N-末端的15个氨基酸残基序列为APALHSQGYTGSNVK,与纳豆激酶一致。结论：经一系列提取纯化方法获得DFE纯品,该酶是一种丝氨酸蛋白酶,可以耐高温和耐碱,与纤维蛋白的亲和力非常高。第三部分豆豉纤溶酶体内外抗栓效果评价目的：评价DFE的溶栓作用,在体外研究其溶解血凝块的作用,在体内评价对大鼠血栓模型的抗栓效果。方法：将DFE配制成不同浓度的溶液。从大鼠体内抽血,自主凝固后形成血凝块,切成若干份。分别加入高、中、低剂量的DFE溶液、生理盐水和UK溶液后,37℃孵育16小时,比较反应前后血凝块重量的变化。选取尾长大于15cm的S-D大鼠,分成DFE高、中、低剂量组,空白对照组、阴性对照组和UK组,先经一侧尾静脉注入各受试药物。30分钟后,结扎尾部,经另一侧尾静脉给予1mg/ml的卡拉胶(κ-carrageenan)溶液,立即冰浴1分钟,20分钟后除去结扎6小时后,测量尾部血栓长度,麻醉大鼠,经腹主动脉取血,制备血浆,测量APTT、TT、PT和D-dimer水平。结果：生理盐水对照组,体外血凝块溶解率只有6.5%,尿激酶组溶解了47.9%的血凝块,DFE中、高剂量组血凝块的溶解率明显升高(59%vs.6.5%,p<0.01；71.7%vs.6.5%,p<0.01),有统计学意义,并呈剂量-反应关系。与空白组进行比较,阴性对照组大鼠尾部血栓平均长度为14.19±0.51cm。UK组的大鼠尾部血栓长度明显小于阴性对照组(10.45±3.02cm,p<0.01)。在DFE中(10.25±3.24cm,p<0.05)、高(8.31±3.32cm,p<0.01)剂量组,大鼠尾部血栓长度均明显短于生理盐水对照组,并呈剂量-反应关系。给药组的大鼠除了尾部血栓长度明显下降外,血栓处的红肿和炎症程度也不如阴性对照组明显。对于APTT,仅DFE中剂量组有统计学意义的增加(p<0.01)。对于PT,尿激酶组和DFE组均明显延长,并具有统计学意义。对于TT,不同组之间不具有统计学差异。阴性对照组的D-dimer水平明显升高,差异有统计学意义(p<0.01)。尿激酶组(p<0.05)和DFE高剂量组(p<0.01),其D-dimer水平均显著高于阴性对照组。结论：DFE在体外溶解血凝块效果明显,在体内也有显著的抑制血栓形成的作用。
