Wnt5a信号通路在胰腺癌侵袭转移中的作用

胰腺癌是发生在胰腺外分泌腺体的消化系统恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的1-4%，其中90%以上为胰腺导管腺癌。胰腺癌1年生存率为8%，5年生存率小于5%，中位生存时间仅4-6个月，死亡率居恶性肿瘤第8位。由于其临床表现隐匿，缺乏敏感性高、特异性强的早期诊断手段，大多数患者就诊时已属中晚期，因而病程凶险，死亡率高，其中侵袭转移是胰腺癌主要致死原因。因此研究胰腺癌的生长侵袭转移特点有重要的临床应用价值。Wnt5a是近年来备受关注的Wnt家族成员。Wnts通过Wnt信号传导系统调控多种细胞功能如增殖、凋亡、分化、迁移及细胞极性等，在生长发育过程中，各成员呈现独特的表达方式和不同的功能。Wnt5a因其广泛参与多种作用途径并在机体发育及疾病发生发展过程中发挥重要作用而备受瞩目。Wnt5a参与众多的生理性和病理性的进程，在多种上皮和间叶性肿瘤中可见Wnt5a蛋白的异常表达。但与经典型Wnts在肿瘤中多表现为表达上调不同，Wnt5a在肿瘤组织中表达并不一致；对Wnt5a蛋白功能的研究在不同肿瘤中也常常得到互相矛盾的结果。Wnt5a对肿瘤的发生发展是致癌还是抑癌因素，众多的实验得出了截然不同的结论。Wnt5a在结直肠癌、神经母细胞瘤及白血病等肿瘤中起抑癌作用，并表达下调。Wnt5a下调与更高的肿瘤分级正相关，且在不同肿瘤亚型中是一个独立的预后不良的因素。而在皮肤黑色素瘤、乳腺癌细胞、胃癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等肿瘤中Wnt5a蛋白过表达且影响肿瘤的迁移和侵袭能力，呈现癌基因的特性。因此Wnt5a在不同的肿瘤中有截然不同的表达方式和功能定位。目前在胰腺癌中，对Wnt5a蛋白表达的研究报道并不一致，其功能和作用机制仍未清楚。为了研究Wnt5a蛋白在胰腺导管腺癌中的表达形式，明确Wnt5a在胰腺导管腺癌中的功能定位，初步探讨其作用机制，我们设计了本课题。目的：观察Wnt5a蛋白在胰腺癌组织中的表达状况，并通过细胞转染技术建立稳定Wnt5a蛋白过表达和低表达的胰腺癌细胞株，检测不同Wnt5a蛋白表达状况对胰腺癌细胞增殖迁移侵袭等生物学行为的影响，初步探讨Wnt5a蛋白影响侵袭转移的途径。方法：○1通过组织芯片Wnt5a蛋白免疫组化染色，分析Wnt5a蛋白在胰腺癌肿瘤组织与癌旁组织中表达的差异；并结合临床病理参数分析Wnt5a与临床病理参数之间的关系；对病例资料进行随访观察，根据不同Wnt5a蛋白表达状况作生存分析。○2构建Wnt5a过表达和干扰质粒，通过脂质体法和电穿孔法将过表达和干扰质粒导入胰腺癌细胞株PANC-1和BXPC-3中，筛选稳转抗性克隆，Western-Blot验证稳转细胞株的Wnt5a蛋白表达状况。○3观察不同Wnt5a蛋白表达水平的胰腺癌细胞株的生物学行为：通过MTT法检测胰腺癌细胞株的生长增殖能力；克隆形成实验检测肿瘤细胞单个细胞体外增殖能力；流式细胞技术检测细胞周期分布和细胞凋亡情况；划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力；裸鼠原位成瘤实验观察各组细胞在裸鼠胰腺原位种植后成瘤及发生侵袭转移能力。○4利用荧光实时定量PCR技术和WesternBlot方法检测转染后细胞EMT关键基因的mRNA和蛋白水平的表达；○5WesternBlot方法检测Wnt5a重组蛋白处理后Wnt5a信号通路相关蛋白的表达；CIAP进行去磷酸化处理。结果：○1通过对134例胰腺癌组织芯片的Wnt5a蛋白免疫组化染色发现胰腺癌癌旁组织中Wnt5a蛋白表达阳性率为16.4%；癌组织阳性率为81.3%；癌与癌旁组织中Wnt5a蛋白表达的阳性率差异有统计学意义，P<0.005。Wnt5a蛋白的表达与临床病理参数之间统计学分析显示：Wnt5a蛋白表达与组织学分级呈负相关（r=-0.360，P=0.000），与其他参数如年龄、性别、肿瘤部位、大小、神经侵犯、淋巴结转移等无关。生存分析无显著性差异。○2构建的过表达和干扰质粒经酶切鉴定和基因测序验证序列正确。分别稳转PANC-1和BXPC-3人胰腺癌细胞株后经抗性克隆和Western-Blot筛选,获得稳定过表达和低表达Wnt5a蛋白的PANC-1及BXPC-3细胞株。○3生物学行为观察结果：生长曲线显示：与相应空载体组相比，两种胰腺癌细胞株过表达组增殖速度均加快，而干扰组则生长受抑制；平板克隆实验显示两种细胞的过表达组体外单个细胞克隆形成能力明显增强；PANC-1干扰组克隆形成能力降低，BXPC-3干扰组克隆形成能力与空载体组间无显著性差异。细胞周期实验显示过表达组及干扰组与相应空载体组之间周期分布均无显著性差异。细胞凋亡实验显示过表达组早晚期凋亡均减少，干扰组早期凋亡增加，与相应空载体组间有统计学差异。划痕试验显示两种细胞的过表达组在24小时时有更多的细胞迁移进入划痕区域，细胞迁移能力增强；相应干扰组细胞迁移能力降低。Transewell小室实验结果显示两组过表达组侵袭能力增加，PANC-1干扰组侵袭能力显著降低。裸鼠原位成瘤实验结果显示过表达组成瘤体积大，突出胰腺范围，在腹腔脏器表面播散。空载体组相对体积小，局限于胰腺内。显微镜下过表达组可见肿瘤组织突破胰腺包膜侵犯邻近腹腔脏器，可见淋巴结转移和肝转移，脉管内可见癌栓。空载体组未见明确转移。○4qRT-PCR结果：BXPC-3和PANC-1细胞过表达组的WNT5A基因相对表达量分别是相应空载体组的1.87倍和2.52倍， WNT5A基因mRNA与蛋白表达结果一致； BXPC-3细胞过表达组的Vimentin基因相对表达量是空载体组的1.96倍，E-Cadherin基因相对表达量是空载体组的0.6倍,两者的差异显著；PANC-1细胞过表达组Vimentin、E-Cadherin基因相对表达量与空载体组之间无显著性差异；BXPC-3和PANC-1过表达组的SNAIL基因相对表达量分别是空载体组的0.33和0.36倍，两者的差异有显著性。蛋白水平检测显示：相比空载体组，过表达组的Wnt5a、Vimentin和Snail蛋白水平较对照组高表达，而E-Cadherin蛋白水平则降低。○5加入重组Wnt5a蛋白，胰腺癌细胞株PANC-1和BXPC-3胞核β-catenin增多；PANC-1和BXPC-3均表达Ror2受体，去磷酸化处理显示Ror2无明确磷酸化。结论：○1Wnt5a蛋白在胰腺癌组织中呈钟形表达模式；○2PANC-1和BXPC-3胰腺癌细胞株过表达Wnt5a在体内外均能使细胞增殖能力增加，迁移和侵袭能力增强；反之，降低Wnt5a的表达则会抑制细胞增殖，降低迁移和侵袭能力；○3过表达Wnt5a蛋白引起了Snail蛋白表达水平上调,伴有Vimentin蛋白和mRNA表达水平的上调，E-Cadherin蛋白和mRNA表达水平的下调，显示Wnt5a蛋白上调诱导了细胞的EMT，从而使细胞侵袭迁移能力增加。Wnt5a对EMT关键因子Snail存在多个水平的调控。○4Wnt5a-Ror2途径无明确激活，胰腺癌中Wnt5a经典途径可能起主导作用。