产核黄素Bacillus subtilis中心代谢途径代谢工程和比较基因组学

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本文首先以调控中心代谢途径通量为代谢工程策略,研究了戊糖磷酸途径和糖异生途径中关键酶基因扰动对枯草芽孢杆菌核黄素合成的影响;其次,利用454 GS FLX高通量测序系统测定了核黄素生产菌B.subtilis 24和B.subtilis RH33的基因组,实现了基于全基因组的突变分析和分类,并构建了用于突变分析和菌株重构的技术平台。利用定点突变技术改造C.glutaminum的zwf和gnd基因,得到解除变构抑制作用的编码酶基因zwf243和gnd361。分别表达zwf243和gnd361时能够显著提高B.subtilis RH33核黄素的合成,核黄素摇瓶产量分别达到4.66g/L和4.82g/L,提高了18.0%和22.0%。两突变基因同时表达时,核黄素摇瓶产量为5.17g/L,葡萄糖限制补料培养核黄素产量为15.7g/L,分别提高了30.9%和39%。基于LC-MS的胞内代谢物谱分析表明,工程菌胞内戊糖磷酸途径代谢物如核黄素及其前体物AIR、DRL和Ru5P浓度均比宿主菌显著增加,提高了15%-46%;相反,三羧酸循环和糖酵解途径中的代谢物浓度比工程菌降低。构建了糖异生途径关键酶基因pckA、gapB和fbp整合型表达载体pUC18-TPA,pUC18-NPB,pUC18-SPF以及fbp与gapB共表达载体pUC18-PFB和fbp,gapB与pckA共表达载体pUC18-PFBA。以葡萄糖为碳源的摇瓶发酵结果表明,fbp基因的过表达对核黄素的合成影响最大,核黄素产量达到4.73g/L,提高18%左右;关键酶基因共表达核黄素发酵结果表明,fbp和gapB基因共表达对核黄素的合成影响最大,产量提高22%左右,达到4.89g/L。利用Roche 454 GS FLX系统测定了核黄素生产菌B.subtilis 24和B.subtilis RH33基因组,平均读长分别为388bp和394bp,覆盖率高达48倍和46倍;结合Sanger法测序补齐缺口,组装全基因组,B.subtilis24和B.subtilis RH33的全基因组的大小分别为4194978bp和4195221bp,G+C含量均为43.55%。全基因组的突变分析表明,B.subtilis 24中含有突变512个,其中插入突变29个,缺失突变20个,替代突变463个;B.subtilis RH33中含有突变549个,其中插入突变31个,缺失突变24个,替代突变494个;两基因组的比对分析结果表明,B.subtilis 24和B.subtilis RH33共有的突变468个,而B.subtilis 24独有的突变44个,B.subtilis RH33独有的突变81个。本文对突变进行了注释,根据突变基因在代谢途径中的功能进行分类,并确定了突变分析验证的原则。利用upp基因作为负筛选标记,建立了枯草芽孢杆菌菌株重构系统。
摘要第3-4页
ABSTRACT第4-5页
第一章 文献综述第10-42页
    1.1 核黄素的发现、理化性质、功能、用途和生产工艺第10-12页
    1.2 B.subtilis 核黄素合成途径及其代谢调节机制第12-19页
        1.2.1 核黄素的合成途径第12-14页
        1.2.2 核黄素的操纵子结构第14-16页
        1.2.3 核黄素合成过程的代谢调节机制第16-19页
    1.3 产核黄素B.subtilis 工程菌的代谢工程策略第19-26页
        1.3.1 基于诱变和基因组重排技术的菌株构建第19-20页
        1.3.2 基于代谢网络模型的代谢工程策略第20-22页
        1.3.3 基于过表达核黄素操纵子的代谢工程策略第22-23页
        1.3.4 基于代谢通量调节的代谢工程策略第23-25页
        1.3.5 基于能量代谢机制的代谢工程策略第25-26页
    1.4 微生物代谢组学的研究进展及其在代谢工程中应用第26-33页
        1.4.1 微生物代谢组学的研究方法第27页
        1.4.2 微生物代谢组学的分析平台第27-29页
        1.4.3 数据挖掘第29-31页
        1.4.4 微生物代谢组学与代谢工程第31-33页
    1.5 高通量基因组测序系统的研究进展第33-39页
        1.5.1 第二代测序技术的发展现状第33-36页
        1.5.2 第三代测序技术第36-37页
        1.5.3 高通量测序技术的应用第37-39页
    1.6 本文的主要技术路线第39-42页
        1.6.1 选题背景第39-40页
        1.6.2 研究内容和技术路线第40-42页
第二章 产核黄素枯草芽孢杆菌戊糖磷酸途径的代谢工程第42-75页
    2.1 实验材料第44-49页
        2.1.1 菌种和质粒第44-45页
        2.1.2 培养基第45页
        2.1.3 主要仪器第45-46页
        2.1.4 主要试剂第46-47页
        2.1.5 主要溶液第47-49页
    2.2 实验方法第49-60页
        2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备第49页
        2.2.2 大肠杆菌质粒DNA 的提取第49-50页
        2.2.3 DNA 片段的回收和纯化第50-51页
        2.2.4 酶切体系第51页
        2.2.5 去磷酸化体系第51页
        2.2.6 内切酶和去磷酸化酶的失活第51-52页
        2.2.7 连接体系第52页
        2.2.8 琼脂糖凝胶电泳第52-53页
        2.2.9 基因定点突变第53-54页
        2.2.10 枯草芽孢杆菌的Spizizen 转化第54页
        2.2.11 枯草芽孢杆菌基因组DNA 的提取第54-55页
        2.2.12 菌体生长特性的考察和摇瓶发酵条件第55页
        2.2.13 发酵液中核黄素和残糖的测定第55-56页
        2.2.14 蛋白质含量的测定第56-57页
        2.2.15 生物量的测定第57-58页
        2.2.16 G6PD 和6PGD 酶活的测定第58页
        2.2.17 微生物胞内代谢物谱分析第58-59页
        2.2.18 发酵罐发酵第59-60页
        2.2.19 引物的设计和基因测序第60页
    2.3 结果与分析第60-74页
        2.3.1 zwf 基因和gnd 基因的定点突变第60-63页
        2.3.2 gnd361 突变基因表达载体的构建第63-65页
        2.3.3 zwf243 突变基因表达载体的构建第65-69页
        2.3.4 突变基因表达工程菌的构建第69页
        2.3.5 In vitro G6PD 和6PGD 酶活分析第69-70页
        2.3.6 工程菌株生长和核黄素发酵表征第70-72页
        2.3.7 胞内代谢物谱分析第72-73页
        2.3.8 工程菌株发酵罐发酵表征第73-74页
    2.4 小结第74-75页
第三章 产核黄素枯草芽孢杆菌糖异生途径的代谢工程第75-94页
    3.1 实验材料第78-79页
        3.1.1 菌株和质粒第78-79页
        3.1.2 实验试剂和溶液第79页
        3.1.3 实验仪器第79页
        3.1.4 培养基第79页
    3.2 实验方法第79页
    3.3 结果与分析第79-93页
        3.3.1 fbp 基因表达载体的构建第80-82页
        3.3.2 pckA 基因表达载体的构建第82-84页
        3.3.3 gapB 基因表达载体的构建第84-86页
        3.3.4 糖异生途径关键酶基因共表达载体的构建第86-88页
        3.3.5 过表达糖异生途径关键酶基因工程菌株的构建第88-91页
        3.3.6 工程菌生长和核黄素摇瓶发酵表征第91-93页
    3.4 小结第93-94页
第四章 产核黄素枯草芽孢杆菌的基因组测序第94-123页
    4.1 实验材料第96-97页
        4.1.1 菌株第96页
        4.1.2 实验试剂第96-97页
        4.1.3 实验仪器第97页
    4.2 实验方法第97-108页
        4.2.1 基因组DNA 的提取第97页
        4.2.2 基因组DNA 的定量分析第97-99页
        4.2.3 基因组DNA 文库的制备第99-102页
        4.2.4 GS FLX Titanium 微乳液聚合酶链式反应(emPCR)第102-103页
        4.2.5 磁珠的回收第103页
        4.2.6 DNA 文库的回收和富集第103-105页
        4.2.7 GS FLX Titanium 测序第105页
        4.2.8 文库回收和样品质量评价方法第105-108页
        4.2.9 基因组缺口(gap)区域的拼接第108页
    4.3 结果与分析第108-122页
        4.3.1 测序过程的质量控制第108-115页
        4.3.2 测序结果第115-117页
        4.3.3 焦磷酸测序的组装第117页
        4.3.4 缺口(gap)区域的拼接第117-119页
        4.3.5 基因组大片段缺失区域的基因及其产物分析第119-121页
        4.3.6 全基因组组装第121-122页
    4.4 小结第122-123页
第五章 产核黄素枯草芽孢杆菌的比较基因组学分析第123-158页
    5.1 实验材料第126-127页
        5.1.1 生物信息学软件第126页
        5.1.2 菌株和质粒第126-127页
        5.1.3 实验仪器第127页
        5.1.4 实验试剂第127页
        5.1.5 培养基第127页
    5.2 实验方法第127-131页
        5.2.1 mRNA 的提取第127-128页
        5.2.2 RealTime-PCR(RT-PCR)第128-129页
        5.2.3 融合PCR (Fusion PCR)第129-131页
        5.2.4 基因克隆第131页
    5.3 结果与分析第131-157页
        5.3.1 基于焦磷酸测序的突变分析第131-135页
        5.3.2 基于全基因组的突变分析第135-136页
        5.3.3 突变基因的注释与分类第136-137页
        5.3.4 Non-ORF 区域的突变分析第137-138页
        5.3.5 部分突变基因密码子偏爱性分析第138-140页
        5.3.6 芳香族氨基酸对测序菌株生长和核黄素合成的影响第140-141页
        5.3.7 枯草芽孢杆菌高效菌株重构系统的建立第141-152页
        5.3.8 菌株重构系统的应用第152-157页
    5.4 本章 小结第157-158页
第六章 结论与展望第158-161页
    6.1 主要结论第158-159页
    6.2 创新点第159-160页
    6.3 展望第160-161页
参考文献第161-174页
发表论文和科研情况第174-175页
附录第175-177页
致谢第177页
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