长牡蛎(Crassostrea gigas)Caspase基因克隆、重组与表达分析
长牡蛎论文 Caspase论文 细胞凋亡论文 RealtimePCR论文 细胞培养论文 体外重组表达
论文详情
本论文以长牡蛎为研究对象,利用长牡蛎幼虫cDNA文库中的EST信息,克隆到长牡蛎凋亡相关Caspase(CgCASP1),通过RealtimePCR分析了该基因在各幼虫阶段的表达特征以及在成体中的组织分布。在原代细胞水平上检测了CgCASP1基因随细胞培养时间增加的表达变化;利用PDTC及H2O2对原代细胞进行刺激诱导凋亡后,分析了CgCASP1和Relish基因mRNA及蛋白水平的表达量变化;构建了体外重组表达载体,并对重组蛋白进行了分离和纯化与活性检测。主要实验的研究结果如下:利用EST提示信息成功克隆了全长为3613bp的CgCASP1基因cDNA序列,其中包含473bp5’UTR及1526bp3’UTR,开放阅读框长1626bp,编码541个氨基酸。该基因编码的蛋白包含caspase家族经典的保守域P20大亚基和P10小亚基,其中五肽保守序列QACRS突变为QACRG。研究发现了长牡蛎CgCASP1的特有片段,并在cDNA及基因组水平上分别进行了验证;通过realtimePCR分析,发现CgCASP1基因在各幼虫时期均有表达,D型幼虫期最高;而成体中鳃的表达量最高,外套膜与肝胰脏中表达量最低。研究发现随着长牡蛎原代细胞培养时间的增加,CgCASP1基因的表达量相应上调;对原代细胞进行H2O2刺激诱导凋亡后Relish基因mRNA表达并无差异,CgCASP1基因表达量显著上调,提示该基因与细胞凋亡相关;PDTC刺激诱导凋亡后下调了Relish基因mRNA表达量,CgCASP1基因没有明显的表达差异;且PDTC刺激后胞质及胞核内的Relish蛋白量均下调,而H2O2刺激后对Relish蛋白无明显作用。在克隆得到CgCASP1基因cDNA全长的基础上,分别构建原核重组表达载体CgCASPl-pEASY-E2和真核重组表达载体CgCASPl-pT7CFE1-Chis进行体外表达:在原核表达系统中得到了约70kD大小的重组蛋白;在真核表达系统中检测了重组蛋白的活性。本论文通过对长牡蛎凋亡相关基因CgCASPl基因的克隆,初步分析了该基因的序列特征和与细胞凋亡的相关性,可以为深入了解软体动物凋亡机制,以及个体发育、形态发生及内源性免疫方面增添新的认识。
致谢 | 第4-5页 |
摘要 | 第5-6页 |
Abstract | 第6页 |
1 绪论 | 第9-24页 |
1.1 引言 | 第9页 |
1.2 长牡蛎(Crassostreagigas) | 第9-11页 |
1.3 Caspase家族 | 第11-16页 |
1.3.1 Caspase结构与分类 | 第11-13页 |
1.3.2 Caspase活化 | 第13-14页 |
1.3.3 Caspase家族功能 | 第14-15页 |
1.3.4 Caspase的作用底物及抑制剂 | 第15-16页 |
1.3.5 软体动物中Caspase的研究进展 | 第16页 |
1.4 细胞凋亡 | 第16-23页 |
1.4.1 凋亡细胞形态特征 | 第16-18页 |
1.4.2 Caspase介导的细胞凋亡途径 | 第18-21页 |
1.4.3 H_2O_2及PDTC诱导凋亡机制 | 第21页 |
1.4.4 细胞凋亡功能 | 第21-22页 |
1.4.5 细胞凋亡的检测方法 | 第22-23页 |
1.5 研究的目的和意义 | 第23-24页 |
2 CgCASPl基因全长的克隆 | 第24-33页 |
2.1 材料方法 | 第24-29页 |
2.1.1 实验材料 | 第24-25页 |
2.1.2 实验方法 | 第25-29页 |
2.2 结果 | 第29-32页 |
2.2.1 CgCASPl基因克隆及序列分析 | 第29-31页 |
2.2.2 CgCASPl基因与其他物种Caspase比较 | 第31-32页 |
2.3 讨论 | 第32-33页 |
3 CgCASPl基因验证及Real-timePCR表达分析 | 第33-39页 |
3.1 材料方法 | 第33-36页 |
3.1.1 实验材料 | 第33-34页 |
3.1.2 实验方法 | 第34-36页 |
3.2 结果 | 第36-38页 |
3.2.1 CgCASPl基因在cDNA水平上的验证 | 第36-37页 |
3.2.2 Caspase片段在基因组水平上的验证 | 第37页 |
3.2.3 不同组织与各幼虫时期CgCASPl基因的表达分布 | 第37-38页 |
3.3 讨论 | 第38-39页 |
4 CgCASPl基因与凋亡相关性的初步研究 | 第39-46页 |
4.1 材料方法 | 第39-42页 |
4.1.1 实验材料 | 第39-40页 |
4.1.2 实验方法 | 第40-42页 |
4.2 结果 | 第42-44页 |
4.2.1 原代细胞中Caspase表达分析 | 第42页 |
4.2.2 PDTC、H_2O_2刺激后CgCASPl和relish基因的表达变化 | 第42-43页 |
4.2.3 PDTC、H_2O_2刺激后Relish蛋白的表达变化 | 第43-44页 |
4.3 讨论 | 第44-46页 |
5 CgCASPl 重组蛋白的体外表达 | 第46-54页 |
5.1 材料方法 | 第46-51页 |
5.1.1 实验材料 | 第46-48页 |
5.1.2 实验方法 | 第48-51页 |
5.2 结果 | 第51-52页 |
5.2.1 CgCASPl重组蛋白的原核表达 | 第51-52页 |
5.2.2 CgCASPl重组蛋白的真核表达 | 第52页 |
5.3 讨论 | 第52-54页 |
结论 | 第54-55页 |
参考文献 | 第55-61页 |
作者简介及攻读学位期间发表的学术论文 | 第61页 |
论文购买
论文编号
ABS563974,这篇论文共61页
会员购买按0.30元/页下载,共需支付
18.3。
不是会员,
注册会员!
会员更优惠
充值送钱!
直接购买按0.5元/页下载,共需要支付
30.5。
只需这篇论文,无需注册!
直接网上支付,方便快捷!
相关论文