长牡蛎(Crassostrea gigas)Caspase基因克隆、重组与表达分析

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本论文以长牡蛎为研究对象,利用长牡蛎幼虫cDNA文库中的EST信息,克隆到长牡蛎凋亡相关Caspase(CgCASP1),通过RealtimePCR分析了该基因在各幼虫阶段的表达特征以及在成体中的组织分布。在原代细胞水平上检测了CgCASP1基因随细胞培养时间增加的表达变化;利用PDTC及H2O2对原代细胞进行刺激诱导凋亡后,分析了CgCASP1和Relish基因mRNA及蛋白水平的表达量变化;构建了体外重组表达载体,并对重组蛋白进行了分离和纯化与活性检测。主要实验的研究结果如下:利用EST提示信息成功克隆了全长为3613bp的CgCASP1基因cDNA序列,其中包含473bp5’UTR及1526bp3’UTR,开放阅读框长1626bp,编码541个氨基酸。该基因编码的蛋白包含caspase家族经典的保守域P20大亚基和P10小亚基,其中五肽保守序列QACRS突变为QACRG。研究发现了长牡蛎CgCASP1的特有片段,并在cDNA及基因组水平上分别进行了验证;通过realtimePCR分析,发现CgCASP1基因在各幼虫时期均有表达,D型幼虫期最高;而成体中鳃的表达量最高,外套膜与肝胰脏中表达量最低。研究发现随着长牡蛎原代细胞培养时间的增加,CgCASP1基因的表达量相应上调;对原代细胞进行H2O2刺激诱导凋亡后Relish基因mRNA表达并无差异,CgCASP1基因表达量显著上调,提示该基因与细胞凋亡相关;PDTC刺激诱导凋亡后下调了Relish基因mRNA表达量,CgCASP1基因没有明显的表达差异;且PDTC刺激后胞质及胞核内的Relish蛋白量均下调,而H2O2刺激后对Relish蛋白无明显作用。在克隆得到CgCASP1基因cDNA全长的基础上,分别构建原核重组表达载体CgCASPl-pEASY-E2和真核重组表达载体CgCASPl-pT7CFE1-Chis进行体外表达:在原核表达系统中得到了约70kD大小的重组蛋白;在真核表达系统中检测了重组蛋白的活性。本论文通过对长牡蛎凋亡相关基因CgCASPl基因的克隆,初步分析了该基因的序列特征和与细胞凋亡的相关性,可以为深入了解软体动物凋亡机制,以及个体发育、形态发生及内源性免疫方面增添新的认识。
致谢第4-5页
摘要第5-6页
Abstract第6页
1 绪论第9-24页
    1.1 引言第9页
    1.2 长牡蛎(Crassostreagigas)第9-11页
    1.3 Caspase家族第11-16页
        1.3.1 Caspase结构与分类第11-13页
        1.3.2 Caspase活化第13-14页
        1.3.3 Caspase家族功能第14-15页
        1.3.4 Caspase的作用底物及抑制剂第15-16页
        1.3.5 软体动物中Caspase的研究进展第16页
    1.4 细胞凋亡第16-23页
        1.4.1 凋亡细胞形态特征第16-18页
        1.4.2 Caspase介导的细胞凋亡途径第18-21页
        1.4.3 H_2O_2及PDTC诱导凋亡机制第21页
        1.4.4 细胞凋亡功能第21-22页
        1.4.5 细胞凋亡的检测方法第22-23页
    1.5 研究的目的和意义第23-24页
2 CgCASPl基因全长的克隆第24-33页
    2.1 材料方法第24-29页
        2.1.1 实验材料第24-25页
        2.1.2 实验方法第25-29页
    2.2 结果第29-32页
        2.2.1 CgCASPl基因克隆及序列分析第29-31页
        2.2.2 CgCASPl基因与其他物种Caspase比较第31-32页
    2.3 讨论第32-33页
3 CgCASPl基因验证及Real-timePCR表达分析第33-39页
    3.1 材料方法第33-36页
        3.1.1 实验材料第33-34页
        3.1.2 实验方法第34-36页
    3.2 结果第36-38页
        3.2.1 CgCASPl基因在cDNA水平上的验证第36-37页
        3.2.2 Caspase片段在基因组水平上的验证第37页
        3.2.3 不同组织与各幼虫时期CgCASPl基因的表达分布第37-38页
    3.3 讨论第38-39页
4 CgCASPl基因与凋亡相关性的初步研究第39-46页
    4.1 材料方法第39-42页
        4.1.1 实验材料第39-40页
        4.1.2 实验方法第40-42页
    4.2 结果第42-44页
        4.2.1 原代细胞中Caspase表达分析第42页
        4.2.2 PDTC、H_2O_2刺激后CgCASPl和relish基因的表达变化第42-43页
        4.2.3 PDTC、H_2O_2刺激后Relish蛋白的表达变化第43-44页
    4.3 讨论第44-46页
5 CgCASPl 重组蛋白的体外表达第46-54页
    5.1 材料方法第46-51页
        5.1.1 实验材料第46-48页
        5.1.2 实验方法第48-51页
    5.2 结果第51-52页
        5.2.1 CgCASPl重组蛋白的原核表达第51-52页
        5.2.2 CgCASPl重组蛋白的真核表达第52页
    5.3 讨论第52-54页
结论第54-55页
参考文献第55-61页
作者简介及攻读学位期间发表的学术论文第61页
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