目的:观察解毒通络调肝方对改善T2DM模型大鼠IR的作用及对衣霉素刺激HepG2细胞炎症因子及蛋白表达的影响。方法:1、以长期高脂颗粒料Purina#5008喂养ZDF大鼠的方法复制实验性2型糖尿病大鼠动物模型。应用中药解毒通络调肝方(高、中、低浓度)对其进行干预,以西药二甲双胍作为阳性药物对照,观察药物对T2DM模型大鼠体质量、尿量、饮水量、糖脂代谢、胰岛素敏感指数及肝组织中IRE1、P-IRE1、JNK,P-JNK、IRS-1及PI3K的表达。2、体外培养HepG2细胞检测解毒通络调肝方不同浓度(12.5ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL)对细胞存活率的影响;以5ug/mL衣霉素刺激HepG2细胞24小时造成内质网应激的模型,应用中药解毒通络调肝方(25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL)对其进行干预,检测炎症因子IL-6、TNF-α及CRP的表达,检测JNK2、IRE-1、NF-κB蛋白表达量。结果:1、对大鼠体质量、饮水量及尿量的影响:西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组体质量虽有下降趋势,但与正常ZL鼠组相比较而言差异仍显著;大鼠饮水量及尿量均明显下降,这与临床上解毒通络调肝方能较好的改善2型糖尿病患者饮水增多,尿量增多的症状相一致。2、对大鼠糖脂代谢的影响:与模型组比较,西药组和解毒通络调肝方高剂量组血糖显著下降,说明西药组和解毒通络调肝方高剂量组在降低血糖,提高胰岛素敏感性、改善抵抗方面对糖尿病大鼠有治疗作用;但西药组与中药高剂量组的糖化血清蛋白及INS与其比较无统计学差异,考虑与用药时间较短有关;与模型组比较,西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组TC、HDL-C及中药高剂量组TG均明显下降;其中解毒通络调肝方高剂量组TG和TC、HDL-C较西药组下降更为明显,说明解毒通络调肝方高剂量组有更好的降脂作用。3、免疫组化方面:对照组ZL鼠无高糖、高脂、肥胖应激状态,肝细胞浆细中无IRE1及P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白的表达,但模型组、西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组,ZDF鼠存在高糖、高脂、肥胖应激状态,并且给药前肝细胞浆中均有IRE1及P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白的表达,证实了通过给予Purina#5008高脂饲料,ZDF鼠可诱导形成糖尿病模型;同时与模型组比较给药后西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组肝细胞胞浆中IRE1、P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白表达明显减少。证实解毒调肝通络汤及二甲双胍均能通过减少IRE1、P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白的表达,抑制IREl-JNK信号通路,起到改善胰岛素抵抗、减少细胞凋亡的作用;给药后解毒通络调肝方高、中、低剂量组肝细胞胞浆中IRE1、P-IREI、JNK及P-JNK蛋白表达比西药组均减少,且以解毒通络调肝方中剂量组减少较为明显,说明解毒通络调肝方中剂量组有较好的改善抵抗,减少凋亡的作用。4、提高肝组织中IRS-1及PI3K的表达量,增加肝组织对胰岛素的敏感性。5、体外细胞培养方面:对于HePG2细胞而言,解毒通络调肝方12.5ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL,与对照组比较,无统计学差异,证实上述浓度的解毒通络调肝方无细胞毒性;HePG2细胞IL-6,TNF-α、CRP及JNK2,NF-κB及IRE-1少量表达,给予衣霉素刺激后,模型组上述炎症因子及蛋白表达较对照组显著升高,证实了通过给予5ug/ml衣霉素处理24小时可造成HepG2细胞内质网应激的模型;同时,解毒通络调肝方高、中、低剂量组IL-6,TNF-α及CRP表达与模型组比较差异显著,其中IL-6,TNF-α的表达以中药高剂量组降低较为明显,证实了解毒通络调肝方可明显抑制内质网应激状态下HepG2细胞相关炎症因子的表达;在蛋白表达方面,中药中剂量组与高剂量组JNK2、NF-κB及中药高中低剂量组IRE-1表达较模型组明显减少,其中以中药高剂量组减少较为明显,说明中药中剂量组与高剂量组能降低JNK2、NF-κB的表达水平,中药高中低剂量组均可降低IRE-1的表达水平。结果显示,本课题的的结果同文献一致,药物干预后起到了胰岛素增敏剂的作用,可减少HepG2细胞相关炎症因子及蛋白的表达。结论:1、解毒通络调肝方能较好的改善2型糖尿病大鼠饮水量增多,尿量增多,减轻大鼠体重,降低血糖、血脂,提高胰岛素的敏感性。2、解毒通络调肝方能通过减少IRE1、P-IREI、JNK及P-JNK蛋白的表达,抑制IRElα-JNK信号通路,同时提高IRS及PI3K的相对表达量,从而起到改善胰岛素抵抗、减少细胞凋亡的作用。3、解毒通路调肝方在12.5ug/ml-150ug/ml无细胞毒性。4、解毒通络调肝方可明显抑制内质网应激状态下HepG2细胞炎症因子及相关蛋白的表达。
