苹果渣固态发酵高蛋白产量菌株筛选及发酵条件研究

随着苹果种植业和加工业的迅速发展,苹果渣的排放量也日趋增加,目前对苹果加工的废弃物——果渣还没有实现有效地综合利用,这不仅影响了苹果产业的可持续发展,也给产区环境造成了极大的污染。苹果渣富含多种营养物质,是良好的发酵原料。本论文以陕西省内苹果园和苹果加工工厂为采集地点,采集不同生长阶段的苹果成熟植株的茎、叶、花、幼果,同时采集了果园土壤、加工厂区土壤、生产线用水、堆积果渣等样本以分离环境微生物,从以上种植、加工贮藏、销售的环境中筛选出纤维素酶活性高的菌株,以及从常见食用菌中优选出能够高效利用苹果渣生长的菌种,以提高苹果渣固态发酵蛋白产量为目的,解决以往研究得到的发酵苹果渣存在的发酵不完全、蛋白含量不高、产物异味严重等问题,并且系统的研究了苹果渣单一菌种发酵和混合菌种发酵、自然发酵和人工发酵等的差异,考察了不同来源的氮源、无机盐等对发酵产物蛋白含量的影响,同时研究了原料配比、温度、接种量、接种比例等因素对产物的影响,确定了最佳苹果渣固态发酵的原料配方和工艺条件；在摇瓶发酵的基础上,研究30L固态罐的发酵条件,同时对固态发酵剂进行了研究。1.2008年2月至2008年10月期间,从陕西省关中及渭北地区3个县6个苹果种植园中采集了不同生长阶段的苹果成熟植株的茎、叶、花、幼果(品种为红富士)及根系土壤样本共计236份,采用组织分离法及土壤稀释平板分离法分离组织表面、体内及土壤中的微生物,经单孢分离及纯化培养后,共得到470个菌株,其中细菌268株,真菌202株。2.从市售苹果表皮、果汁加工厂的生产线、商品浓缩苹果汁和果渣堆积环境中采集土壤、水、果汁和果渣样本120份,采用经典的分离和纯化方法共得到207个菌株,其中细菌121株,真菌86株。3.对上述677株纯化后的菌株通过透明圈法进行初筛后,对筛选得到的76株菌株进行以纤维素酶活为指标的复筛,得到高产纤维素酶的菌株5株,经形态学初步鉴定,其分属于镰孢属Fusarium sp.,酵母属Saccharomyces sp.,木霉属Trichoderma sp.和曲霉属Aspergillus sp.。通过发酵苹果渣试验,对产品进行蛋白含量、感官指标等评价,确定菌株T23,T55,T62为优势菌株,均具有生长对数期较长,发酵周期内纤维素酶活性较高等优势。经过显微形态及ITS序列分析、同源性比较,依次鉴定为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,产朊假丝酵母Candida utilis和黑曲霉Aspergillus niger,依次命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae Y1N4,产朊假丝酵母Candida utilis Y2N3和黑曲霉Aspergillus nigerH1N3。4.对苹果干渣的主要组成成分进行了定量分析,其中粗纤维含量约为14.7%,粗蛋白含量约为4.2%,作为培养基原料在生产中需要添加氮源。5.通过单因素试验确定了苹果渣固态发酵的最佳摇瓶工艺：外加氮源为10%(质量含量)麸皮；灭菌采用常规方式,在实际生产中也可采用100℃,30min蒸煮灭菌；含水量为60%。本研究采用的黑曲霉、酿酒酵母、产朊假丝酵母,单菌发酵和混菌发酵均能显著提高产物蛋白含量,以混菌发酵苹果渣效果最佳,在发酵周期内蛋白含量、纤维素酶活性都有明显增长。本研究还考察了菌种的混合比例、混合种类、接种量及分段发酵对产物蛋白含量的影响,同时研究了温度和发酵时间的影响,得到以下结论：采用黑曲霉,酿酒酵母,产朊假丝酵母等量混合的方式接种,接种量为12%(培养基的质量百分比浓度),先接入黑曲霉发酵48h后接入两种酵母菌,得到的发酵苹果渣蛋白含量最高,可达34.9%。在摇瓶发酵的基础上,研究30L卧式固态发酵罐的发酵条件,当选择温度为27℃,通气速率为0.65 N.m3/h,接种量为600 mL(每5kg培养基),搅拌速度为15rpm时,产物蛋白质含量为最大值31.6%。发酵苹果渣饲料中氨基酸组分齐全,赖氨酸等必需氨基酸含量较高,同时富含酶类、核酸、维生素、无机盐和促进动物生长因子、生物学价值优于植物蛋白饲料,可以替代豆粕和鱼粉。另外,添加稻壳能够明显改善培养基的通气状况,添加纤维素酶也能明显增加原料粗纤维的降解效率,提高发酵产物的质量。6.培养四种食用菌凤尾菇Pleurotus sajor-caju、白灵菇Pleurotus nebrodensis、猴头菇Hericium erinaceus、茶树菇Agrocybe chaxinggu的试验结果表明,食用菌菌丝在苹果渣上生长旺盛,麸皮是苹果果渣发酵生产食用菌菌丝的理想氮源,优于尿素、硝酸铵和硫酸铵等合成氮源。发酵后苹果渣的蛋白含量由发酵前的4%左右提高到20%以上。以生长最为旺盛的凤尾菇为例,添加少量无机盐溶液(KH2PO4, MgSO4, ZnSO4),发酵处理能够进一步提高苹果渣的蛋白含量。MgSO4, K2HPO4和ZnSO4的含量分别为18g/kg、3g/kg和0.03g/kg时,接种凤尾菇的苹果渣发酵产物蛋白含量最高,可达26.178%。7.从六种供试物(甲基纤维素,B-环糊精,可溶性淀粉,壳聚糖,魔芋粉和麸皮)中,筛选最适合用于苹果渣固态发酵的发酵剂载体。试验结果表明,壳聚糖对酿酒酵母具有最强的吸附力,且发酵力的大小与六种载体对酿酒酵母吸附量的大小呈正相关,其次为β-环糊精,综合考虑成本及产品外观形状等,选择B-环糊精最为发酵剂的理想载体材料。考察温度、pH、时间、媒介等因素对B-环糊精与酵母吸附能力的关系,确定最佳吸附条件为：温度25℃,pH为6.5,吸附时长为12 h,溶液介质为0.01M的CaSO4时,冻干后其吸附力达到8.2×106 CFU/g,为工业化发酵生产提供理论依据。