IDO基因过表达诱导小鼠肺移植慢性排异免疫耐受的实验研究

背景：肺移植是目前治疗终末期肺病唯一有效方法，术后一年生存率可达71%，但5年生存率低于50%，为目前实体器官移植中最低。影响肺移植患者长期生存的主要原因为移植后的慢性排异，其特征性表现为闭塞性细支气管炎（ObliterativeBronchiolitis，OB），而现有的免疫抑制剂常无法逆转。诱导供体或受体自身免疫抑制或免疫耐受，对预防和治疗移植后急慢性排异的发生，延长移植物存活、提高受体的生活质量都具有重要的意义。IDO（indoleamine2，3-dioxygenase，吲哚胺2，3二加氧酶）为细胞内一种色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶，在诱导自身免疫疾病、母胎免疫耐受、肿瘤免疫逃逸及移植免疫耐受等方面均发挥重要的调节作用，被称为免疫抑制酶。研究发现，通过基因治疗调控IDO的表达可以保护细胞和组织移植物，诱导产生移植后免疫耐受。本课题设计建立小鼠颈部异位气管移植模型来模拟肺移植慢性排异过程，并构建重组腺病毒IDO基因表达载体转染供体小鼠气道上皮，使之高表达IDO，研究移植气道上皮IDO过表达在减轻闭塞性细支气管炎，诱导肺移植慢性排异免疫耐受中的作用及可能机制，为今后适用于临床提供理论依据。第一部分Gateway技术构建重组腺病毒IDO基因表达载体目的：利用Gateway分子克隆技术构建含报告基因EGFP的重组腺病毒IDO基因表达载体，并对经菌落PCR筛选、测序鉴定的重组腺病毒载体进行病毒包装、纯化及滴度测定。方法：利用Gateway分子克隆技术方案，由重叠PCR先扩增、合成含attB1-kozak-IDO1/IRES/EGFP-attB2目的基因片段，再经BP反应合成pDown-IDO1/IRES/EGFP目的基因入门克隆，最终由LR反应合成pAV.Ex1d-CMV>IDO1/IRES/EGFP重组腺病毒目的表达载体。将以上经菌落PCR筛选、测序鉴定正确的载体质粒转染HEK293A包装细胞扩增，收集、纯化含病毒颗粒上清液，采用TCID50法测定病毒滴度。结果：基因测序鉴定经菌落PCR筛选的pDown-IDO1/IRES/EGFP及pAV.Ex1d-CMV>IDO1/IRES/EGFP载体质粒，其基因序列与实验设计IDO基因序列完全一致。导入HEK293A包装细胞后，可见报告基因EGFP亮绿色荧光蛋白表达。TCID50法测定病毒滴度为3.16×1010PFU/ml。结论：成功构建含报告基因EGFP的重组腺病毒IDO基因表达载体，导入HEK293A包装细胞后能产出高滴度的重组腺病毒用于转基因治疗。第二部分IDO基因转染小鼠气道上皮的可行性研究目的：将携带IDO基因的重组腺病毒载体转染体外培养的小鼠气道上皮，观察气道上皮细胞IDO基因转染的表达效率及酶活性；同时建立经气道病毒转染模型，探讨IDO基因活体转染气道上皮的可行性。方法：原代提取、培养小鼠气道上皮细胞，行IDO基因重组腺病毒转染，同时设空载体转染组和空白组对照。荧光显微镜下观测各组气道上皮细胞生物活性及病毒转染效率，并经qRT-PCR、Western blot技术检测上皮细胞IDO mRNA及蛋白表达水平。收集各组培养液上清，采用高效液相色谱法（HPLC）检测上清液中色氨酸及犬尿氨酸含量以评估气道上皮细胞中IDO酶活性。建立小鼠经气道病毒转染模型，观察小鼠气道上皮IDO基因转染的表达时效及生物安全性。结果：采用感染复数MOI=50病毒量体外转染气道上皮24h后，其转染效率可达100%，但荧光较弱，提高MOI值，荧光随之增强，而细胞状态没有太大的差异。qRT-PCR、Western blot检测IDO基因转染后气道上皮细胞IDO mRNA及蛋白表达水平较空载体组、空白组明显增高（P<0.01）。经气道转染腺病毒，IDO基因大部分表达于气道上皮且持续时间超过3周，无呼吸系统损伤。HPLC检测发现，无论培养液上清，还是气道组织，IDO基因转染组的IDO活性皆显著高于空载体组和空白对照组（P<0.01）。结论：携带IDO基因的腺病毒在体内外皆可稳转气道上皮过表达IDO基因及蛋白，且具有酶活性。经气道途径转染腺病毒载体，气道上皮转染率、安全性高，时效可超过3周。第三部分IDO基因过表达诱导CD4~＋T细胞/BMDCs免疫耐受第一节IDO基因过表达诱导CD4~＋T细胞增殖抑制目的：通过建立小鼠气道上皮细胞与CD4~＋T细胞体外共培养体系，探讨气道上皮细胞IDO基因过表达对CD4~＋T细胞增殖活性、早期凋亡的影响及在上调CD4+CD25+Treg细胞FoxP3表达，诱导免疫耐受中的作用。方法：分别建立空白组、IDO转染组、GFP转染组、1-MT干预组小鼠气道上皮细胞与磁珠分选、纯化的CD4~＋T细胞共培养体系。经CD3/CD28刺激共培养72h后，采用CCK8法、AnnexinV-FITC与PI双染法检测各组CD4~＋T细胞增殖活性、早期凋亡率。采用混合淋巴细胞反应（MLR）、流式细胞分析检测各组共培养后CD4~＋T细胞免疫功能及CD4+CD25+Treg细胞中FoxP3表达变化。采用HPLC检测各组共培养液上清中IDO活性。结果：经体外刺激共培养72h后，CCK8法检测IDO转染组CD4~＋T细胞增殖刺激指数（SI）明显低于对照组、GFP空载体组（P<0.01）；当加入IDO特异性抑制1-MT后，增殖指数明显升高（P<0.01）。AnnexinV-FITC与PI双染法检测IDO转染组早期凋亡率明显高于对照组、GFP转染组（P<0.01），加入1-MT后早期凋亡率下降（P<0.01）。流式细胞分析CD4~＋T细胞表型发现，IDO转染组Treg细胞FoxP3表达比例显著高于对照组、GFP空载体组（P<0.01）；加入1-MT后，FoxP3表达下降（P<0.01）。MLR检测各组共培养后CD4~＋T细胞刺激脾淋巴细胞增殖能力显示：IDO转染组脾淋巴细胞增殖抑制率明显高于对照组、GFP空载体组（P<0.01），当加入1-MT处理后，其刺激脾淋巴细胞增殖抑制率下降（P<0.01）。HPLC检测各组共培养液上清中IDO活性，其IDO转染组显著高于对照组及GFP转染组（P<0.01）；加入1-MT后IDO活性下降（P<0.01）。结论：共培养体系中，气道上皮IDO基因过表达能明显抑制CD4~＋T细胞活化增殖，诱导其凋亡；并可上调CD4+CD25+Treg细胞表达FoxP3，产生免疫耐受；此种效应为IDO依赖性，可被其阻滞剂1-MT所阻断。第二节IDO基因过表达对BMDCs成熟分化的影响目的：体外扩增、培养BMDCs细胞，观察其成熟、表型分化特点。通过建立小鼠气道上皮细胞与BMDCs刺激共培养体系，探讨气道上皮细胞IDO基因过表达对BMDCs成熟、表型分化的影响及在诱导BMDCs免疫耐受中的作用。方法：采用rGM-CSF（10ng/ml）、rIL-4（4ng/ml）体外扩增、培养BMDCs，观察其形态学及表型成熟分化特点。于培养第7d分别建立与空白组、IDO转染组、GFP转染组、1-MT干预组小鼠气道上皮细胞在LPS（1ug/ml）刺激下共培养体系。72h后，采用流式细胞分析检测各组BMDCs中MHCII、CD86/80表型分化变化，并由混合淋巴细胞反应（MLR）评价其免疫功能，HPLC检测各组共培养液上清中IDO活性。结果：体外扩增、培养BMDCs，7d前为未成熟DCs，经LPS（1ug/ml）刺激培养72h后可分化为成熟DCs。未成熟BMDCs与各组气道上皮细胞经LPS刺激共培养72h后，IDO转染组BMDCs表面MHCII、CD80/86分子表达明显低于对照组、GFP转染组（P<0.01）；加入1-MT后DCs细胞表面分子表达增强（P<0.01）。MLR评价各组共培养后BMDCs刺激脾淋巴细胞增殖能力显示：IDO组BMDCs刺激脾淋巴细胞增殖率明显低于对照组、GFP转染组（P<0.01）；加入1-MT后，其刺激脾淋巴细胞增殖能力增强（P<0.01）。HPLC检测各组共培养液上清中IDO活性，IDO组显著高于对照组、GFP转染组（P<0.01），加入1-MT后IDO活性下降（P<0.01）。结论：共培养体系中，气道上皮细胞IDO基因过表达可明显抑制BMDCs表面MHCII、CD80、CD86分子的表达，阻碍其进一步分化成熟，诱导其产生耐受性。且此种效应为IDO依赖性，可被其阻滞剂1-MT所阻断。第四部分小鼠异位气管移植模型模拟肺移植慢性排异目的：建立小鼠异位气管移植模型来模拟肺移植后慢性排异特征性表现闭塞性细支气管炎（OB）的病理过程，为研究肺移植慢性排异提供实验平台。方法：30只小鼠随机分入实验组、对照组，每组各15只，分别进行小鼠颈部异位气管移植。其中实验组受体为C57BL/6（H-2b）近交系小鼠，对照组为BALB/c（H-2d）近交系小鼠，两组供体气管皆取自BALB/c近交系小鼠。各组分别于术后7d、14d、28d随机处死5只受体鼠，取移植气管进行组织病理学评价、CD3+T细胞免疫组化染色分析、并测定其气管闭塞程度。结果：实验组移植气道免疫病理损伤随移植时间延长而加重，28d移植气道完全闭塞，与临床闭塞性细支气管炎的病理过程相似。实验组病理评分、CD3+T细胞浸润及气管闭塞程度显著高于对照组（P<0.01）。结论：小鼠异位气管移植模型可模拟肺移植后慢性排异-闭塞性细支气管炎的免疫病理过程。该模型操作简单，建模稳定，可用于肺移植慢性排异的相关研究。第五部分IDO基因过表达减轻肺移植慢性排异-闭塞性细支气管炎的研究目的：在小鼠异位气管移植模型基础上，探讨小鼠移植气道上皮IDO基因过表达在诱导肺移植慢性排异免疫耐受，减轻闭塞性细支气管炎中的作用及可能的机制。方法：60只受体C57BL/6（H-2b）小鼠随机平均分入对照组、IDO转染组、GFP转染组、1-MT干预组，建立颈部异位气管移植模型。供体移植气管皆取自BALB/c（H-2d）小鼠，其中IDO组供体气管经重组IDO腺病毒转染，GFP组供体气管经空载体转染7d后移植。各组于术后7d、14d、28d随机处死5只受体鼠，取异位移植气管进行组织病理学、CD3+T细胞免疫组化检查，并对IDO组移植气管进行冰冻切片，荧光显微镜下观察移植后IDO基因表达情况。建模第7d，取各组移植气管及旁淋巴结组织，进行组织内T淋巴细胞增殖活性及Th17、Treg细胞流式检测。实验末，采用HPLC检测外周血、移植气管及旁淋巴组织内IDO活性。结果：各实验观察点IDO组移植气道免疫病理损伤明显较其他组为轻，其病理评分、CD3+T细胞浸润及气管闭塞程度显著低于对照组、GFP转染组、1-MT干预组（P<0.05）。对IDO组移植气管进行冰冻切片，荧光显微镜下观察：移植后IDO基因表达可持续4周。流式细胞检测移植后7d气道组织及旁淋巴结T细胞增殖活性，IDO组T细胞增殖率明显低于其他各组，同时Treg细胞比例增多，Th17细胞比例相应减少，差异有统计学意义（P<0.01）。HPLC检测移植气道、旁淋巴组织及血浆内IDO活性，IDO组明显高于其他各组（P<0.01）；而血浆内各组IDO活性比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：移植气道上皮IDO基因过表达能减轻闭塞性细支气管炎免疫病理损伤，诱导肺移植慢性排异免疫耐受，其机制可能与移植气道上皮局部IDO活性增高，减轻组织T淋巴细胞浸润，抑制T淋巴细胞增殖活化，诱导初始T细胞分化由Th17细胞向Treg细胞偏移有关。