转移抑制基因MTSS1在胃癌侵袭转移中的研究

胃癌所具有的高转移特性是该类型肿瘤预后较差的主要原因，深入探索其相关机制对提高患者生存率意义重大。候选基因MTSS1作为一种新近发现的肿瘤转移抑制基因，目前研究认为其通过影响细胞骨架的改变迁移等而与肿瘤的侵袭转移相关联。该基因在肿瘤中的研究目前尚是新的领域，迄今为止国内外尚无有关于胃癌中的实验研究报道。本实验拟研究MTSS1在胃癌组织中多水平的表达情况及其与患者临床病理的相关性，同时检测MTSS1杂合性缺失的情况，以明确在肿瘤进程中该基因失活可能的机制。并在此基础上深入研究MTSS1在体内外对胃癌细胞侵袭转移生物学行为的影响及其可能的机制。通过本课题的研究，可将MTSS1挖掘成为一种对于肿瘤的预后与转移具有指示作用的新兴标志物以及阻断胃癌转移的可能靶点。第一部分MTSS1在人胃癌组织中的表达与临床病理特征及预后的关系目的:研究MTSS1在人类胃癌中的表达情况及其与临床病理的相关性，以初步探讨MTSS1在人类胃癌中表达的生物学意义。方法:在包含胃癌癌旁正常粘膜、原发灶、淋巴结或其他转移灶的胃癌组织样本1072例的组织芯片中，利用免疫组化、RT-PCR等实验技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测MTSS1的表达。并结合临床病理资料对实验结果统计分析，探寻MTSS1在人胃癌中表达的临床意义。结果：(1)胃癌组织及胃癌淋巴结或其他转移组织中MTSS1蛋白表达强度和表达率较癌旁正常粘膜组织中明显下降。MTSS1在胃癌原发灶组织中表达缺失率为70.1%(751/1072)，在胃癌淋巴结及其他转移灶中表达缺失率达88%(103/117)。RT-PCR、Western blot中结果趋势也同上较一致。(2) MTSS1在胃癌中的表达与较多因素相关：随着肿瘤分化程度向低或未分化进展，MTSS1=的表达逐渐减少，故与肿瘤分化程度相关(P<0.001)。另其与肿瘤大小(P=0.005)，肿瘤浸润深度，组织类型、淋巴结转移以及TNM分期均相关(P<0.001)。(3)MTSS1的表达与患者的生存期呈正相关，MTSS1表达下降或缺失的胃癌患者其预后较MTSS1表达阳性的患者明显较差(18months vs76months; P <0.001)。并且MTSS1与肿瘤浸润、淋巴结转移及TNM分期等因素一样，成为影响胃癌患者的独立预后因素之一。结论：MTSS1表达下降或缺失在胃癌的发生发展过程中可能起着重要作用，该基因与胃癌患者的预后密切相关，是一个潜在的判断预后有效指标。第二部分MTSS1在胃癌组织中表达缺失的相关机制研究目的:探讨肿瘤转移抑制候选基因(Metastasis suppressor1,MTSS1)在胃癌发生、发展以及侵袭转移中的可能的分子机制。方法：运用PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染法对含癌旁正常粘膜、原发灶、淋巴结转移或转移灶的胃癌组织样本各13例MTSS1基因位点上4个微卫星位点(D8S1832D8S2132D8S1179D8S1461)进行杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)检测。结果：在MTSS1表达阴性的胃癌原发及转移组织中LOH发生率较高，总LOH率分别为46.15%和69.23%。结论：MTSS1基因位点频繁的杂合性缺失可能在胃癌的发生、发展以及侵袭转移中起到了一定的作用。第三部分转移抑制基因MTSS1在胃癌侵袭转移中的细胞学功能研究目的:应用定向基因克隆技术，构建MTSS1基因真核表达载体pEGFP-N1-MTSS1，建立并鉴定能稳定表达外源MTSS1基因的胃癌细胞系。通过基因双向表达调控以研究MTSS1基因对AGS和MGc80-3细胞生物学行为的影响及其可能的机理。方法：1、通过基因克隆技术获得人MTSS1基因cDNA序列，将其克隆至T载体，测序正确后，经酶切、回收并连接到真核细胞表达载体pEGFP-N1，构建pEGFP-N1-MTSS1表达载体，经酶切鉴定、测序正确后，用脂质体转染技术将pEGFP-N1-MTSS1表达载体和设计合成的干扰序列ShRNA431分别转染人胃癌细胞株AGS和MGc80-3细胞，根据绿色荧光蛋白的表达率确定转染效率，利用Realtime-PCR、免疫印迹法鉴定表达产物，紫外-可见分光光度法测定MTSS1活性的改变。2、以成功构建的分别能稳定表达外源pEGFP-N1-MTSS1，瞬转ShRNA431，空载体pEGFP-N1/对照NC的胃癌细胞系和未转染的AGS/MGc80-3细胞为研究对象，通过MTT比色、平板克隆集落形成、transwell小室侵袭迁移实验以及裸鼠体内成瘤实验等一系列细胞学功能实验及周期观察，探索胃癌细胞株中MTSS1的表达对肿瘤细胞增殖、周期、侵袭、迁移等的影响。结果：1、成功构建了pEGFP-N1-MTSS1表达载体，经鉴定显示MTSS1在AGS细胞中过表达，活性测定证实转染组的MTSS1活性较对照组明显升高。基因MTSS1的过表达与干扰效率均较高。2、对转染前后的细胞观察表明，重组体转染组细胞生长减慢，克隆形成率降低，对胃癌细胞的迁移、侵袭有所抑制。细胞周期检测中MTSS1过表达组细胞被阻滞于G2/M期。裸鼠体内成瘤也受到抑制。干扰组中尽管生长改变差异无统计学意义，但MTSS1干扰后细胞的迁移、侵袭以及体内成瘤的能力均较对照组增强。结论：本部分研究从体内外揭示了基因MTSS1参与了调控人类胃癌细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为。MTSS1在对于影响胃癌患者的预后的相关事件中可能起到重要作用。