糠醛和苯酚对酵母作用定量蛋白质组学及脂肪酸模块构建

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研究纤维素水解液中抑制剂对酿酒酵母的抑制作用机理是获得抑制剂耐受酵母菌株的重要基础,有利于酿酒酵母直接利用纤维素水解液生产乙醇。本文采用了相对定量蛋白质组学的手段从蛋白水平上研究了两种主要纤维素抑制剂糠醛和苯酚对酿酒酵母的作用机理。采用18O定量蛋白质组学研究了致死浓度17 g/L糠醛分别作用于酿酒酵母普通菌株和糠醛耐受菌株20 min和2 h,致死浓度0.04 mol/L苯酚作用于酿酒酵母普通菌株20 min以及苯酚耐受菌株20 min和40 min的蛋白质表达量的相对变化,分别得到了76、66、53、48、15、46和23个相对表达量发生变化的蛋白。对这些蛋白进行功能分类分析。与蛋白质合成相关的蛋白是抑制剂所引起的差异蛋白的主体部分,且大部分蛋白的相对表达量都受抑制剂影响上调。此外,在受到显著影响的细胞功能中,为糠醛所特有的包括能量、碳化合物和碳水化合物代谢以及嘌呤核苷酸的代谢;为苯酚所特有的是质子平衡;为糠醛和苯酚耐受菌株所特有的是氨基酸代谢;苯酚和糠醛在20 min都影响酵母的转录,2 h影响酵母的代谢。发现了糠醛相关的可能生物标志物醇脱氢酶Adh1p和葡萄糖蛋白激酶Glk1p;糠醛和苯酚的共同可能生物标志物外周膜蛋白Zeo1p、液泡ATP酶V1部分的亚单位A Tfp1p和核糖体蛋白Rpl32p。采用iTRAQ相对定量蛋白质组学研究了在非致死浓度8 g/L糠醛作用下酿酒酵母蛋白表达水平的动态变化(0 h、20 min、2 h和3 h)。iTRAQ时间序列数据显示糠醛的加入使与蛋白质合成相关蛋白的表达量下调的过程,与葡萄糖发酵和三羧酸循环相关蛋白的表达量的上调过程受到延滞。参与含硫氨基酸合成途径上游部分的蛋白的表达在整个糠醛转化过程中受到严重抑制,这表明糠醛加入可能降低了酿酒酵母细胞内的L-甲硫氨酸。这些相对定量蛋白质组学数据使人们更进一步的了解抑制剂对酿酒酵母的作用机制,为采用基因工程改造获得抑制剂耐受菌株提供了有用的信息和生物靶标。运用双水平细胞代谢模型和基因敲除对大肠杆菌的脂肪酸模块进行模拟设计与构建,获得脂肪酸产量提高45%的敲除菌株。通过敲除基因dgkA和过表达WS/DGAT酶,成功地将三酰甘油合成途径引入大肠杆菌BL21 Star DE3。为利用大肠杆菌脂肪酸途径,生产对细胞无毒害的三酰甘油,构建油脂大肠杆菌奠定了基础。
摘要第3-4页
ABSTRACT第4-5页
前言第10-12页
第一章 文献综述第12-31页
    1.1 生物燃料的研究现状和挑战第12-16页
        1.1.1 生物燃料的研究现状第12-15页
        1.1.2 生物燃料面临的挑战第15-16页
    1.2 纤维素抑制剂问题第16-20页
        1.2.1 抑制剂的产生和毒性第17页
        1.2.2 抑制剂的脱毒第17-19页
        1.2.3 微生物对抑制剂胁迫响应机理的研究和组学手段的介入第19-20页
    1.3 定量蛋白质组学第20-27页
        1.3.1 定量蛋白质组学的相关技术第20-24页
        1.3.2 ~(18)O 标记定量蛋白质组学第24-25页
        1.3.3 iTRAQ 定量蛋白质组学第25-26页
        1.3.4 定量蛋白质组学在溶剂耐受性研究中的应用第26-27页
    1.4 代谢工程在生物燃料中的应用第27-28页
    1.5 利用脂肪酸途径生产生物燃料第28-29页
    1.6 本课题的研究意义和研究内容第29-31页
        1.6.1 研究意义第29页
        1.6.2 研究内容第29-31页
第二章 酿酒酵母对糠醛响应的~(18)O 标记定量蛋白质组学研究第31-61页
    2.1 引言第31-32页
    2.2 材料与方法第32-41页
        2.2.1 主要仪器第32页
        2.2.2 主要试剂第32-33页
        2.2.3 酿酒酵母的培养第33-34页
        2.2.4 发酵参数测定第34页
        2.2.5 样品的提取,~(16)O/~(18)O 标记和2D-LC-MS/MS 分析第34-37页
        2.2.6 定量实时PCR (RT-PCR)第37-40页
        2.2.7 NAD+/NADH 和ATP/ADP 分析第40-41页
    2.3 结果与讨论第41-60页
        2.3.1 糠醛对酿酒酵母的表征影响第41-44页
        2.3.2 酿酒酵母在蛋白质水平上对糠醛的响应第44-55页
        2.3.3 ~(18)O 定量蛋白质组学定量结果的验证第55-60页
    2.4 小结第60-61页
第三章 糠醛耐受酿酒酵母对糠醛响应的~(18)O 标记定量蛋白质组学研究第61-75页
    3.1 引言第61-62页
    3.2 材料与方法第62-63页
        3.2.1 主要仪器第62页
        3.2.2 主要试剂第62页
        3.2.3 糠醛耐受酿酒酵母菌株的适应进化第62页
        3.2.4 酿酒酵母的培养第62-63页
        3.2.5 发酵参数测定第63页
        3.2.6 蛋白样品的提取,~(16)O/~(18)O 标记和2D-LC-MS/MS 分析第63页
    3.3 结果与讨论第63-74页
        3.3.1 糠醛耐受菌株的表征第63-65页
        3.3.2 酿酒酵母糠醛耐受菌株在蛋白质水平上对糠醛的响应第65-67页
        3.3.3 与蛋白质合成相关的差异蛋白第67-68页
        3.3.4 与细胞代谢相关的差异蛋白第68-69页
        3.3.5 与压力胁迫相关的差异蛋白第69-71页
        3.3.6 与细胞运输、运输细胞器和运输途径相关的差异蛋白第71-74页
    3.4 小结第74-75页
第四章 酿酒酵母原始菌株和苯酚耐受菌株对苯酚响应机制的比较蛋白质组学研究第75-93页
    4.1 引言第75-76页
    4.2 材料与方法第76-77页
        4.2.1 主要仪器第76页
        4.2.2 主要试剂第76页
        4.2.3 苯酚耐受酿酒酵母菌株的适应进化第76页
        4.2.4 酿酒酵母的培养第76-77页
        4.2.5 发酵参数的测定第77页
        4.2.6 蛋白样品的提取,~(16)O/~(18)O 标记和2D-LC-MS/MS 分析第77页
    4.3 结果与讨论第77-92页
        4.3.1 相对比较蛋白质组学的定量情况第77-78页
        4.3.2 酿酒酵母普通菌株对苯酚在蛋白质水平上的响应情况第78-80页
        4.3.3 酿酒酵母耐受菌株对苯酚在蛋白质水平上的响应情况第80-85页
        4.3.4 糠醛和苯酚相关~(18)O 标记定量蛋白质组学数据的比较第85-92页
    4.4 小结第92-93页
第五章 酿酒酵母对非致死浓度糠醛的响应机制的时间序列定量蛋白质组学研究第93-112页
    5.1 引言第93页
    5.2 材料与方法第93-97页
        5.2.1 主要试剂第93页
        5.2.2 主要仪器第93-94页
        5.2.3 酿酒酵母在发酵罐中的培养第94页
        5.2.4 发酵参数的测定第94页
        5.2.5 蛋白样品的制备和iTRAQ 试剂的标记第94-95页
        5.2.6 利用强阳离子交换柱分离蛋白样品第95页
        5.2.7 1-D nano-LC/MS/MS 分析第95-96页
        5.2.8 数据分析第96-97页
    5.3 结果与讨论第97-110页
        5.3.1 非致死浓度糠醛(8 g/L)对酿酒酵母乙醇发酵的影响第97-98页
        5.3.2 酿酒酵母在蛋白质水平上对非致死糠醛浓度的响应情况第98-102页
        5.3.3 蛋白质合成第102-103页
        5.3.4 含硫氨基酸生物合成途径第103-105页
        5.3.5 碳中心代谢第105-108页
        5.3.6 压力胁迫响应第108-110页
    5.4 小结第110-112页
第六章 以大肠杆菌为底盘细胞构建合成脂肪酸类产品的功能模块第112-129页
    6.1 引言第112-113页
    6.2 材料与方法第113-118页
        6.2.1 菌种和培养条件第113页
        6.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和热转化第113-114页
        6.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备和电转化第114-115页
        6.2.4 质粒的提取第115页
        6.2.5 PCR 扩增第115-116页
        6.2.6 琼脂糖凝胶电泳第116页
        6.2.7 基因敲除第116-117页
        6.2.8 脂肪酸和三酰甘油的分析第117-118页
        6.2.9 HPLC 分析第118页
    6.3 结果与讨论第118-128页
        6.3.1 整个代谢途径改造的设计第118-121页
        6.3.2 利用合成生物学的模块化理念对脂肪酸途径进行理性改造第121-122页
        6.3.3 基因组简化的底盘细胞的构建和表征第122-125页
        6.3.4 三酰甘油的合成模块构建与功能发挥第125-128页
    6.4 小结第128-129页
第七章 结论和展望第129-133页
    7.1 结论第129-131页
    7.2 创新点第131页
    7.3 展望第131-133页
参考文献第133-144页
发表论文和参加科研情况说明第144-145页
致谢第145页
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