中国明对虾Rac1/PI3K/Akt通路相关基因的克隆和功能关系的初步研究

对虾养殖病害的频发给对虾水产养殖业的发展造成了巨大损失。深入开展对虾免疫机制的研究，可为制定有效的病害防治策略、维持对虾养殖业的可持续发展提供理论依据。Toll通路是无脊椎动物抵抗外界病原体感染的重要信号通路。在对中国明对虾转录组数据进行生物信息学分析的基础上找到了由Toll受体所介导的Rac1/PI3K/Akt通路的相关因子Rac1、PI3K以及Akt。Rac1作为一种小分子量GTP结合蛋白，是众多信号通路的重要组成分子，在细胞迁移、细胞增殖、免疫防御、细胞骨架重组等多种生命过程中发挥着重要作用；PI3K和Akt作为Rac1/PI3K/Akt通路中Rac1的下游因子，是细胞内重要的信号传导分子，它们通过参与多种细胞分子反应来实现其重要的生物学功能。本论文克隆了Rac1、PI3K催化亚基和Akt基因的cDNA序列，分析了其推导的氨基酸序列的特征，研究了它们的组织分布，同时研究了它们在应答不同病原刺激时的转录表达变化情况。通过RNAi的方法初步研究了它们之间的功能关系，提示Rac1/PI3K/Akt通路在对虾免疫中的重要作用。具体如下：中国明对虾的Rac1基因（FcRac1）开放阅读框（ORF）为579bp，共编码192个氨基酸，具有保守的RHO结构域。FcRac1蛋白与其他物种的Rac1蛋白具有较高的相似性；系统进化分析表明，FcRac1蛋白在亲缘关系上更接近节肢动物的Rac1蛋白。Real-time PCR分析显示，FcRac1在血细胞中的表达量最高。RNA原位杂交分析表明，FcRac1在不同类型的血细胞中广泛存在。对虾在注射细菌（溶壁微球菌或鳗弧菌）1h后，FcRac1的转录表达显著上调；在注射白斑综合症病毒（WSSV）的3－72h内，FcRac1的转录表达也出现不同程度的变化，说明FcRac1蛋白可能参与了对虾的抗菌或抗病毒免疫。中国明对虾PI3K的催化亚基基因（FcPI3Kc）的ORF为3222bp，编码1073个氨基酸，具有PI3Kc蛋白的五个特征性结构域。FcPI3Kc与其他物种的PI3K催化亚基相似性较高。定量PCR分析发现FcPI3Kc在对虾血细胞中的表达量最高。对虾注射细菌（溶壁微球菌或鳗弧菌）1h时，FcPI3Kc的转录表达显著上调；注射WSSV3小时后， FcPI3Kc在转录水平上出现一定程度的下调表达。中国明对虾蛋白激酶Akt基因（FcAkt）的开放阅读框（ORF）为1536bp，编码511个氨基酸，具有保守的PH结构域、催化功能域及调节结构域。FcAkt与地蟹、果蝇、埃及伊蚊、家蚕等节肢动物的蛋白激酶B（Akt/PKB）的亲缘关系较近。FcAkt的转录表达在不同细菌或WSSV注射后也显示出明显的变化，提示FcAkt可能在对虾的免疫防御中发挥了重要作用。对虾注射不同的细菌后，FcRac1、FcPI3Kc及FcAkt的转录表达均存在明显变化，说明三个基因都在对虾买免疫中起一定作用。在FcRac1被干扰后，FcPI3Kc的转录表达也出现明显下调，而FcAkt的转录表达显著上调，由此确定FcRac1、FcPI3Kc及FcAkt三个基因之间存在一定的相互作用。