基于iTRAQ技术筛选抑郁症相关血浆蛋白和氨基酸的初步研究

背景抑郁症是一种常见的神经精神疾病，具有高发病率，高复发率，高致残率，高自杀率，低就诊率以及低治愈率等特点，造成了严重的社会负担。目前抑郁症的临床诊治存在诸多挑战，主要表现在：（1）临床诊断主要依赖于病史的询问而缺乏有效的辅助诊断指标/方法。（2）作为抑郁症主要治疗措施的抗抑郁药存在起效慢，有效率不高等不足。这些与抑郁症发病机制不清有密切关联。深入了解抑郁症的病理生理机制，将有助于我们对抑郁症进行早期有效诊断以及选择合适的抑郁症治疗方案。蛋白质组学和代谢组学作为系统生物学研究中的代表性研究技术，已被证明是探索疾病病理生理机制，筛选潜在疾病诊断生物标志物的重要手段。目的本研究旨在通过比较蛋白质组学研究技术（双向凝胶电泳和多维液相色谱分离结合串联质谱鉴定）以及代谢组学研究技术（血浆游离氨基酸检测分析）检测分析抑郁症患者外周循环血液蛋白质、氨基酸的改变，并初步探讨差异蛋白、氨基酸在抑郁症病理生理机制中的潜在作用及其临床意义，为筛选有利于抑郁症诊断和病情监测的生物标志物提供前期基础。方法本研究分为三部分：第一部分，基于双向凝胶电泳技术的抑郁症血浆比较蛋白质组学初步研究；第二部分，基于iTRAQ技术的抑郁症血浆比较蛋白质组学初步研究；第三部分，基于iTRAQ技术的抑郁症血浆游离氨基酸检测分析及其意义。主要方法及技术路线如下：1．研究对象的纳入与排除。根据前期制定的抑郁症患者以及健康对照纳入与排除标准，分别在重庆医科大学附属第一医院精神科以及体检中心纳入首发未用药抑郁症患者和健康对照人群。共42例研究对象（抑郁症，健康对照各21例）纳入比较蛋白质组学研究；而氨基酸检测分析研究共纳入51例研究对象（抑郁症组，健康对照组分别26例，25例）。2．血浆标本的采集与保存。经肘正中静脉采集空腹（至少12小时）静脉血（8:00-10:00am）4-5ml于EDTA抗凝管中，并于采集后1小时内分离血浆（离心参数：1500g*15min，室温）。血浆于冰上等量分装后，迅速保存于-80℃并做好信息登记，备后续分析用。3．采用双向凝胶电泳技术筛选抑郁症可能相关的血浆差异蛋白。等量混合不同研究组的血浆样品，并采用Bio-Rad公司Clean-Up试剂盒进行预处理后，以Bradford法测定样品蛋白浓度后，用双向凝胶电泳分离蛋白质，凝胶经过考马斯亮蓝染后才有Bio-Rad公司PDQuest软件进行凝胶图像分析。胶内酶解差异蛋白点，并串联质谱鉴定。免疫印迹法（Western Blotting，WB）进行差异蛋白验证。4．基于同位素标记相对和绝对定量（Isobaric tags for relative andabsolute quantitation, iTRAQ)标记，多维液相色谱分离结合串联质谱鉴定筛选抑郁症可能相关的血浆差异蛋白。血浆样品采用Agilent公司专利产品多重亲和去除系统（MultipleAffinity RemovelSystem， MARS）去除血浆中的7种高丰度蛋白（白蛋白，免疫球蛋白G，抗胰蛋白酶，免疫球蛋白A，转铁蛋白，触珠蛋白以及纤维蛋白原）。收集的低丰度蛋白组分进行除盐、变性、还原、烷基化、酶解以及iTRAQ标记，经过二维液相色谱（强阳离子/反相色谱）分离后，采用精确质量四级杆-飞行时间串联质谱仪（Hybrid Triple Quadrupole Time-of-Flight MassSpectrometry, Q-TOF-MS）进行蛋白鉴定。所得质谱数据在IPI蛋白数据库进行蛋白检索鉴定，Mascot软件进行差异蛋白数据分析。随后，进一步采用MetaCore数据库分析差异蛋白的相互作用关系以及参与的代谢通路，并采用WB以及酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunoadsorbent assays，ELISA）进行验证分析。5.基于iTRAQ标记定量的血浆游离氨基酸的检测分析。血浆样品经过预处理后，采用氨基酸iTRAQ标记试剂盒对样品进行标记。标记完成后，将标记样品与预先标记的氨基酸标准品混合。混合样品经液相色谱分离后采用三重四级杆/线性离子阱质谱（Hybrid TripleQuadrupole/Linear Ion trap mass spectrometer,QTRAP-MS）分析鉴定。数据采用ABI公司MarkerViewTM(version1.4.2)软件进行处理，SPSS16.0统计软件包对检测结果进行统计分析。结果1．采用双向凝胶电泳对全血浆进行差异蛋白分析，抑郁症组三次重复检测到的蛋白点数分别为189,197,185（190.33±6.11，均数±标准差），健康对照组三次重复检测到的蛋白点数分别为208,204,205（205.66±2.08，均数±标准差）。两组凝胶电泳图谱之间的匹配率约为81%。研究结果未发现两研究组之间存在差异蛋白。2．采用基于iTRAQ标记定量的差异蛋白分析策略，发现载脂蛋白D（apolipoprotein D，Apo D）, α白蛋白（afamin， AFM），载脂蛋白B100（apolipoprotein B100， Apo B100）， α1B糖蛋白（α-1B-glycoprotein， A1BG），维生素D结合蛋白1型（isoform1ofvitamin D-binding protein， VDP）,铜蓝蛋白（ceruloplasmin， Cp），富含组氨酸的糖蛋白（histidine-rich glycoprotein， HRG），信号素3F（semaphorin-3F， S3F）以及α2巨球蛋白（α-2-macroglobulin， A2M）等9个蛋白在两组的表达存在差异，其中前5种蛋白在抑郁症组中上调，后4种蛋白在抑郁症组中则下调。3.蛋白功能分析提示差异蛋白主要参与脂质代谢和免疫调节等生物学过程。WB验证结果提示，混合样品中A1BG和HRG的表达水平在两组间无统计差异（P＞0.05），而AFM，Apo D, Cp和VDP等的表达水平则与蛋白组学结果一致，且具有统计学差异（P＜0.05）。而42份单个样品的验证结果显示，上述4个蛋白在抑郁症组和健康对照组之间的表达趋势与蛋白组学结果一致，但差异未达到统计学意义（P＞0.05）。ELISA验证结果示Apo B100和A2M血浆表达水平在两组人群之间具有统计学差异（P＜0.05）。4.血浆氨基酸检测结果提示，与健康对照组相比，色氨酸，γ氨基丁酸以及赖氨酸等氨基酸在抑郁症组中表达水平显著降低（P＜0.05）；在抑郁症患者组中β氨基异丁酸以及天冬氨酸血浆浓度分别与17-汉密尔顿抑郁量表得分呈显著负相关（P＜0.05）；回归分析结果显示色氨酸、半胱氨酸和谷氨酰胺组成的预测模型对抑郁症和健康对照两组人群具有较好的判别区分效果（ROC曲线下面积=0.900）。结论1．血浆中白蛋白，球蛋白等高丰度蛋白严重影响低丰度蛋白的检测。高丰度蛋白去除是血浆比较蛋白质组学的必要预处理环节。2．比较蛋白质组学是一种有效的探索抑郁症病理生理机制以及筛选抑郁症潜在生物标志物的研究手段。脂质代谢以及免疫调节紊乱参与抑郁症早期病理生理过程。血浆Apo B100和A2M可能是潜在的抑郁症生物标志物。3．色氨酸，γ氨基丁酸以及赖氨酸等氨基酸代谢异常可能参与抑郁症发病机制；血浆氨基酸浓度（β氨基异丁酸以及天冬氨酸）可能用于抑郁症病情严重程度的监测指标；循环氨基酸表达水平分析具有潜在的抑郁症诊断价值。