南方红豆杉内生真菌多样性、次生代谢产物及其与宿主的相关性研究

本课题以我国珍稀保护药用植物南方红豆杉内生真菌为研究对象，对其生物多样性及代谢产物和其与宿主的相关性进行系统地研究，以期为开发新的天然药物资源和提高药材品质提供新的思路。与已报道的同属植物相比，南方红豆杉具有更加丰富的内生真菌种类。从3个产地（江西井冈山、浙江景宁、重庆缙云山）南方红豆杉3个部位（叶片、枝条、树皮中）共分离得到2442株内生真菌，根据菌株群落的培养特征及5.8S和ITS区片段序列相似性比较和系统发育分析，共鉴定为145个分类单元（分子鉴定143个分类单元，2个未能进行分子鉴定的形态型），归属到真菌界3个门6个纲20个目66个属，其中125个分类单元（占总数的86.2%）属于子囊菌门，14个（占9.8%）属于担子菌门，5个（3.4%）属于接合菌门，1个（0.7%）未确定分类地位。南方红豆杉内生真菌生物多样性及丰度受组织类型影响显著，枝条、树皮中内生真菌多样性及丰度为叶片的1.2-3倍。地理位置、组织类型对南方红豆杉内生真菌组成及分布具有显著的影响，优势类群（目、属、种水平上）存在产地间、部位间明显差异。鉴定的145个分类单元中，仅10个分类单元为3个地点共有，20个分类单元为2个地点共有，其他分类单元只在1个地点出现。Hypoxylon、Pezicula、Pestalotiopsis为不同产地特有的优势属；最优势目Magnaporthales、Botryosphaeriales、Glomerellales、Diaporthales、Xylariales、Helotiales、Hypocreales，最优势属Phyllosticta/Guignardia、Colletotrichum/Glomerella、Phomopsis、Hypocrea/Trichoderma、Pezicula的分布具有显著的组织特异性。大多数优势种都表现出明显的地理特异性或组织特异性，许多分离频率低的菌还表现出地理专一性或组织专一性。由于产地和部位的作用，更多种类的内生真菌从南方红豆杉中获得。南方红豆杉丰富多样的内生真菌种类是极其重要的资源宝库，为内生真菌后续研究工作提供了重要素材。利用高效液相色谱法测定有效成分（Taxol、10-DABⅢ）的含量，并结合南方红豆杉相关化学成分的HPLC-TOF/MS数据分析，比较3个产地南方红豆杉3个部位化学成分包括有效成分的差异。结果表明南方红豆杉Taxol与10-DABⅢ含量存在部位间、产地间显著差异。3个产地的南方红豆杉的Taxol含量均以树皮部位明显高于枝条、叶片部分，且以江西产地树皮含量最高；3个产地的南方红豆杉10-DABⅢ含量则均以叶片明显高于枝条、树皮部分，且以江西产地叶片中含量最高。从化学成分质谱数据初步鉴别结果来看，南方红豆杉植物中的化学成分极为复杂，包含紫杉烷类化合物，部分松香烷类、木脂素类等化合物。南方红豆杉叶片、枝条、树皮3个部位化学成分的差异显著，这与内生真菌菌群部位间的差异结果相符。通过对飞行时间质谱数据的PLSDA分析筛选出18个在部位间分布有明显差异的化合物，比对确立的南方红豆杉化学成分数据库初步鉴别出11个化合物，8个紫杉烷二萜类（P2、P5-P7、N1、N2、N7-N9）、1个松香烷二萜类（N6）、和2个木脂素类（N3、N5）。进一步考察南方红豆杉化学成分包括有效成分与内生真菌之间的关系，发现18个部位间差异化合物的量与一些具有组织特异性的内生真菌有关，它们之间存在正相关关系和负相关关系，表明内生真菌部位间的差异与宿主植物部位间成分差异相关。有效成分（Taxol与10-DABⅢ）含量与一些有组织特异性的优势类群的分布存在显著的相关性。与Taxol含量显著相关的有：在目水平上，Helotiales、Hypocreales、Xylariales目；在属水平上，Hypocrea，Pezicula属；在种水平上，Hypocrealixii。与10-DABⅢ的含量显著相关的有：在目水平上，Botryosphaeriales、Magnaporthales目；在属水平上，Fusarium/Gibberella、Phyllosticta/Guignardia属；在种水平上，Colletotrichumgloeosporioides,Glomerella lindemuthiana,Magnaporthales sp.2、Xylariales sp.1。Taxol或10-DABⅢ的含量和与其相关的不同内生真菌类群的相对频率之间的关系均最符合立方模型（CubicModel）。研究阐明内生真菌对药材品质（有效成分的含量）的影响，对提高药材品质、筛选优质药材具有重要的理论价值和现实意义。通过稻瘟霉模型筛选和与宿主化学成分比较分析相结合的方法，对鉴定的145个内生真菌分类单元发酵提取物进行筛选，以Perenniporiatephropora（Z41）的抗稻瘟霉活性最好，并且与宿主共有的分子特征离子数目最多，因此对该菌发酵物乙酸乙酯提取部位进行分离，利用波谱方法共鉴定了5个化合物，1个新型的倍半萜类化合物PerenniporinA和4个已知化合物2-5依次为ergosterol、rel-(+)-(2aR,5R,5aR,8S,8aS,8bR)-decahydro-2,2,5,8-tetramethyl-2H-naphtho[1,8-bc]furan-5-ol、albicanol、para-methoxybenzoicacid，这些化合物都是首次从Perenniporia属真菌分离得到。Perenniporia tephropora发酵物的乙酸乙酯提取物（EPT）及5个化合物对HeLa细胞，SMMC-7721和PANC-1细胞系具有较好的细胞毒活性。倍半萜类化合物1、3、4都是潜在的肿瘤抑制剂。以生物活性和化学成分分析相结合的方法筛选得到的担子菌门内生真菌Perenniporia tephropora在筛选活性或新型化合物展现出较好的应用前景。