SIRT1在胃癌恶性生物学表型中的作用和机制研究

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胃癌是严重危害人类健康的疾病之一,其发病率和死亡率在所有肿瘤中高居第四位和第二位。虽然在世界范围内胃癌的发病率和死亡率呈逐年下降趋势,但全世界每年仍有90万新发胃癌病例、70万人死于胃癌,其中我国就有30万人。纵然众多的新型化疗药物和靶向药物被广泛应用,晚期胃癌疗效仍然很差,其5年生存率在20%-30%,因而寻找胃癌早期诊断的分子标志物以及新的潜在治疗靶点就尤为重要。SIRT1隶属于sirtuin家族,与酵母SIR2高度同源,为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性的组蛋白去乙酰化酶。它一方面通过修饰组蛋白,去乙酰化H1K26、H3K9和H4K16位点,维持染色质处于沉默状态、保持基因组稳定;另一方面通过去乙酰化众多的非组蛋白,参与调控细胞的能量代谢、增殖、凋亡、衰老和神经退行性病变等。近年来,针对SIRT1在肿瘤发生发展中的作用,也进行了一些研究,但研究结果千差万别,主要体现在:SIRT1在不同肿瘤组织中的表达水平不够统一;SIRT1对抑癌基因和促癌基因的影响尚不能形成定论;SIRT1调控细胞增殖、凋亡、参与DNA修复的作用及长期应用SIRT1激动剂对延长寿命、降低肿瘤发病风险未能达成共识。目前SIRT1对胃癌恶性生物学表型的影响还知之甚少,SIRT1在胃癌发生发展中究竟是发挥抑癌作用还是促癌作用也不明确,因而有必要进行深入研究探讨。【目的】1、观察SIRT1在胃癌中的表达情况,分析其表达水平与临床病理学特征间的相关性,探讨其潜在的临床价值;2、研究SIRT1在胃癌恶性生物学表型中的作用;3、探讨SIRT1影响胃癌恶性生物学表型的可能分子机制。【方法】1、收集西京消化病医院手术切除的胃癌组织、癌旁组织和转移淋巴组织标本;2、利用免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR从蛋白水平和mRNA水平检测SIRT1在胃癌组织、相应的癌旁组织和转移淋巴结中的表达情况,统计分析其表达水平与胃癌患者临床病理学特征之间的相关性,揭示SIRT1潜在的临床应用价值;3、利用免疫组织化学染色的方法检测SIRT1上游调控分子DBC1、下游靶分子p53的表达,分析DBC1、p53与SIRT1在胃癌组织中的表达一致性;4、构建包装SIRT1shRNA慢病毒载体(LV-SIRT1-shRNA)、SIRT1过表达慢病毒载体(LV-SIRT1)和相应的对照载体(LV-shRNA-Control和LV-Control),感染GES和SGC7901细胞,筛选获得稳定转染株,Western-Blot证实载体的有效性;5、利用SIRT1的激动剂(resveratrol)和抑制剂(EX-527)改变GES和SGC7901细胞内源性SIRT1的活性;6、采用MTT实验、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验观察SIRT1表达和(或)活性改变对GES和SGC7901细胞体外增殖能力以及克隆形成能力的影响;7、应用裸鼠体内成瘤实验结合活体成像的方法观察SIRT1对SGC7901细胞体内成瘤能力的影响;8、采用流式细胞术检测各种慢病毒载体感染、resveratrol和EX-527处理的GES和SGC7901细胞在细胞周期和细胞凋亡方面的变化;9、应用Western blotting方法检测细胞周期、细胞凋亡关键调控分子的表达变化,初步探讨SIRT1影响细胞周期和细胞凋亡的分子机制;【结果】1、SIRT1在胃癌组织、转移淋巴结中的表达明显低于相应的癌旁组织利用两种不同的SIRT1抗体(santa cruz公司和upstate公司)对112例胃癌组织、相应的癌旁组织和38例转移淋巴结组织进行了免疫组化染色。结果发现,两种不同的SIRT1抗体呈现相似的染色模式,在癌旁组织SIRT1主要定位于胞浆,而在胃癌组织SIRT1既可定位于胞浆,又可表达于胞核。我们发现,在112例胃癌组织中有81例SIRT1表达阴性、24例SIRT1表达弱阳性、4例SIRT1表达中等强度阳性和3例SIRT1表达强阳性,SIRT1的表达阳性率为27.7%;在112例癌旁组织中SIRT1表达有7例阴性、26例弱阳性、38例中等强度阳性和41例强阳性,SIRT1的表达阳性率为93.7%;在38例转移淋巴结中SIRT1表达有34例阴性、4例弱阳性、0例中等强度阳性和0例强阳性,SIRT1的表达阳性率为10.5%;统计学分析表明SIRT1在胃癌组织、转移淋巴结中的表达明显低于相应的癌旁组织(P<0.01)。进一步分析SIRT1的染色评分下降幅度与胃癌患者临床病理学特征之间的相关性时,发现SIRT1的染色评分下降幅度与组织学分化程度、TNM分期密切相关(P<0.05),分化程度越低、TNM分期越差,SIRT1的染色评分下降就越明显,但与年龄、性别、淋巴结转移以及远处转移无关(P>0.05)。此外,我们利用实时荧光定量PCR检测了SIRT1在24例新鲜胃癌组织和相应癌旁组织中的表达情况,结果发现,SIRT1mRNA在新鲜胃癌组织中的表达明显低于相应的癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.01)。2、下游分子p53与SIRT1在胃癌存在表达一致性,而上游分子DBC1与SIRT1不存在表达相关性针对SIRT1的下游分子p53,我们利用免疫组化检测了其在40例胃癌组织中的表达,结果发现p53的表达阳性率为30%;共定位分析提示,40例胃癌组织中有SIRT1(+)p53(+)的8例、SIRT1(+)p53(-)的5例、SIRT1(-)p53(+)的4例、SIRT1(-)p53(-)的23例,统计学分析表明p53与SIRT1在胃癌中的表达呈正相关(P=0.003)。针对SIRT1的上游分子DBC1,我们利用免疫组化检测了DBC1在53例胃癌组织中的表达,结果发现DBC1的表达阳性率为77.4%;共定位分析提示,53例胃癌组织中有SIRT1(+)DBC1(+)的13例、SIRT1(+)DBC1(-)的2例、SIRT1(-)DBC1(+)的28例、SIRT1(-)DBC1(-)的10例,统计学分析表明DBC1与SIRT1在胃癌中的表达不相关(P>0.05)。3、SIRT1抑制GES和SGC7901细胞的体外增殖能力为了探讨SIRT1对GES和SGC7901细胞体外增殖能力的影响,我们成功构建包装了LV-SIRT1-shRNA、LV-shRNA-Control、LV-SIRT1和LV-Control慢病毒载体,感染GES和SGC7901细胞。Western-Blot证实LV-SIRT1-shRNA感染GES和SGC7901细胞后,SIRT1的表达水平明显下调,而LV-SIRT1感染GES和SGC7901细胞后,SIRT1的表达水平显著增加。MTT实验显示,LV-SIRT1-shRNA感染的GES和SGC7901细胞,其生长速度明显快于LV-shRNA-Control感染的GES和SGC7901细胞(P<0.05);反之,与LV-Control载体感染的GES和SGC7901细胞相比,LV-SIRT1感染的GES和SGC7901细胞增殖速度明显减缓(P<0.05)。平板克隆和软琼脂克隆形成实验表明,与对照载体相比,LV-SIRT1-shRNA感染的SGC7901细胞克隆形成能力明显增强、克隆形成数目明显增加,而LV-SIRT1感染的SGC7901细胞克隆形成能力明显降低、克隆形成数目明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,为了明确内源性SIRT1对GES和SGC7901细胞的体外增殖能力的影响,我们采用SIRT1的激动剂(resveratrol)和抑制剂(EX-527)改变GES和SGC7901细胞内源性SIRT1的活性,用MTT检测细胞增殖能力,结果发现,EX-527抑制SIRT1的活性后,可以加速GES和SGC7901的增殖,但无统计学差异;而resveratrol活化SIRT1的活性后,可以显著减缓GES和SGC7901的增殖速度,差异具有统计学意义(P<0.05)。4、SIRT1抑制SGC7901细胞的体内成瘤能力为了进一步证实SIRT1对SGC7901细胞增殖能力的影响,我们进行了裸鼠成瘤实验和活体成像研究,结果发现LV-SIRT1-shRNA感染的SGC7901细胞在裸鼠体内所形成的肿瘤体积和重量明显大于LV-shRNA-Control感染的SGC7901细胞,其相应的活体成像荧光信号明显增高(P<0.05);反之,LV-SIRT1感染的SGC7901细胞在裸鼠体内所形成的肿瘤体积和重量明显小于LV-Control感染的SGC7901细胞,其相应的活体成像荧光信号显著降低(P<0.05)。5、SIRT1阻滞GES和SGC7901细胞周期进展无限增殖是肿瘤细胞的重要特征之一,因此我们利用流式细胞术检测了SIRT1对GES和SGC7901细胞周期进展的影响。我们发现利用慢病毒LV-SIRT1-shRNA下调SIRT1的表达,细胞周期中G1期比例在GES细胞从58.5%下降到41.9%(P<0.05),在SGC7901细胞从46.5%下降到37.8%(P<0.05);反之,利用慢病毒LV-SIRT1上调SIRT1的表达,细胞周期中G1期比例在GES细胞从57.6%上升到64.6%(P<0.05),在SGC7901细胞从45.1%上升到58.9%(P<0.05)。此外,我们还利用SIRT1的激动剂(resveratrol)和抑制剂(EX-527)改变细胞内源性SIRT1的活性,结果发现,抑制SIRT1的活性可以减少细胞周期中G1期比例(P<0.05),在GES细胞G1期所占比例由59.8%下降到47.4%,在SGC7901细胞G1期所占比例由55.3%下降到41.1%;然而,激动SIRT1的活性可以增加细胞周期中G1期比例(P<0.05),在GES细胞G1期所占比例由59.8%上升到69.6%,在SGC7901细胞G1期所占比例由55.3%上升68.1%。这些结果提示SIRT1可以抑制细胞周期由G1期向S期进展。为了进一步证实SIRT1对细胞周期进展的影响,我们检测了细胞周期关键调控分子Cyclin D1、CDK4和Rb的表达变化。Western-Blot结果提示,下调SIRT1的表达可以增加Cyclin D1和CDK4表达,但不引起Rb的表达变化;反之,上调SIRT1的表达可以抑制Cyclin D1和CDK4表达,但不改变Rb的表达。6、SIRT1促进GES和SGC7901细胞发生凋亡抵抗凋亡是肿瘤细胞的另一重要特征,因此我们利用流式细胞术检测了SIRT1对GES和SGC7901细胞凋亡的影响。我们发现,与LV-shRNA-Control感染的细胞相比,利用LV-SIRT1-shRNA下调SIRT1的表达可以显著减少细胞凋亡,对于GES细胞,凋亡细胞由7.6%减少到3.8%(P<0.05);对于SGC7901细胞,凋亡细胞由9.8%减少到4.8%(P<0.05)。反之,利用LV-SIRT1上调SIRT1的表达可以明显增加细胞凋亡,对于GES细胞,凋亡细胞由6.3%增加到16.5%(P<0.05),对于SGC7901细胞,凋亡细胞由9.6%增加到21.6%(P<0.05)。此外,我们还利用resveratrol和EX-527改变细胞内源性SIRT1的活性,结果也发现,干扰SIRT1的活性可以抑制细胞凋亡,而激活SIRT1的活性可以促进细胞发生凋亡。这些结果提示SIRT1可以促进细胞发生凋亡。为了探讨SIRT1影响细胞凋亡的可能分子机制,我们检测了细胞凋亡关键调控分子Bcl-2和Bax的表达变化。Western-Blot结果提示,下调SIRT1的表达可以增加Bcl-2表达,减少Bax的表达,升高Bcl-2/Bax的比率;反之,上调SIRT1的表达可以减少Bcl-2表达,增加Bax的表达,降低Bcl-2/Bax的比率。【结论】本研究证实SIRT1在胃癌组织中的表达明显低于相应的癌旁组织,其表达水平与下游分子p53的表达呈明显正相关;下调SIRT1的表达和(或)活性可以促进胃癌细胞的体内外增殖、促进细胞周期进展、抑制细胞凋亡;上调SIRT1的表达和(或)活性可以抑制胃癌细胞的体内外增殖、抑制细胞周期进展、促进细胞凋亡;其机制可能与改变Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax这些细胞周期、细胞凋亡关键调节蛋白的表达相关。本研究提示SIRT1在胃癌的发生发展中可能扮演抑癌基因的角色,进而为SIRT1激动剂的临床应用提供了潜在的理论依据。
缩略语表第6-8页
中文摘要第8-14页
Abstract第14-21页
前言第22-23页
文献回顾第23-42页
    一、去乙酰化和去乙酰化酶第23-24页
    二、Ⅲ类去乙酰化酶-sirtuins 家族第24-28页
    三、SIRT1第28-36页
    四、SIRT1 与肿瘤第36-42页
第一部分 SIRT1 在胃癌组织和癌旁组织中的表达第42-60页
    1 材料第43-44页
    2 方法第44-49页
    3 结果第49-56页
    4 讨论第56-60页
第二部分 SIRT1 对 GES、SGC7901 细胞生长增殖的影响第60-84页
    1 材料第60-62页
    2 方法第62-72页
    3 结果第72-80页
    4 讨论第80-84页
第三部分 SIRT1 对 GES、SGC7901 细胞周期和细胞凋亡的影响以及机制研究第84-96页
    1 材料第84-85页
    2 方法第85-87页
    3 结果第87-93页
    4 讨论第93-96页
小结第96-97页
参考文献第97-106页
附录第106-108页
个人简历和研究成果第108-110页
致谢第110-111页
论文购买
论文编号ABS4029071,这篇论文共111页
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