血管钠肽对低氧诱导的心肌细胞、心成纤维细胞以及血管平滑肌细胞生长的抑制调节

低氧是心血管疾病中普遍的现象，不仅急性心梗时伴有缺氧，在许多临床情况下也存在心肌绝对或相对供氧不足。研究表明，低氧应激能够通过调节生长因子、酶、应激蛋白质等的基因表达，调节细胞的生长和分化，因此，研究低氧对心肌细胞、心成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的作用对于明确低氧性心血管疾病的发生机制有重要意义。 钠尿肽家族是由具有利钠、利尿和舒血管效应的一组多肽组成，近年来该家族成员对心肌肥厚和血管重建的负调控作用及其临床应用前景受到关注。血管钠肽(Vasonatrin peptide,VNP)是人工合成的钠尿肽家族新成员，研究表明VNP能防治低氧条件下大鼠肺动脉高压和右心室肥厚的形成，并能抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖。VNP抑制心室肥厚的作用，除了通过降低心脏后负荷的间接机制，是否对心肌细胞、心成纤维细胞的生长有直接作用，目前尚不清楚。VSMCs的异常增殖除了参与肺动脉高压的形成，还与动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄过程中血管内膜的增厚关系密切，VNP对肺动脉之外的其它血管平滑肌的异常增殖是否有调节作用尚无报道。 钠尿肽受体(natriuretic peptide receptors,NPRs)有A、B、C三个亚型，其中A、B(NPR-A、B)受体是鸟苷酸环化酶(GC)耦联受体，与配体结合后引起细胞内cGMP水平升高，而C受体不与GC耦联，主要通过结合和内化(internalize)钠尿肽而发挥清除受体的功能。正常情况下，三种受体在体内均广泛分布，但在不同组织中的分布有很大差异，而且在不同病理条件下钠尿肽受体数目还可发生上调和下调，提示钠尿肽家族及其受体对不同组织器官的作用不同，并参与它们的生理和病理过程的调节。 本工作研究了VNP对低氧诱导的培养新生大鼠心肌细胞、心成纤维细胞和人血管平滑肌细胞生长的影响和机制，旨在为VNP的临床应用提供实验依据。 第四军医大学博士学位论文 研究目的： l）观察不同程度低氧对心肌细胞生长的直接作用，研究VNP对低氧诱导的心肌 肥大和凋亡的影响及作用机制。 二）观察低氧对心成纤维细胞增殖和胶原合成的影响，研究VNP抑制心肌间质结 构重建的机制。 3）观察在冠状动脉旁路移植术（coronap artery bypass grafting，CABG）中用于移 植的血管——乳内动脉（internal mammny rtery IMA）和大隐静脉（saphenous vein， SV）的血管平滑肌细胞的增殖和凋亡，并研究VNP抑制IMA和SV血管平滑肌细胞 增殖的作用。 研究方法： l）以培养的新生大鼠心肌细胞为研究对象，用四哇盐（MTT）比色实验、总蛋 白质含量测定和h．亮氨酸掺入实验等方法观察细胞数和蛋白质合成情况，通过测定 乳酸脱氢酶（LDH）的活性反映细胞损伤，用流式细胞仪、TU’NEL染色和电镜技术 研究细胞凋亡，用放免法测定VN’P对细胞内。GMP、cAMP以及培养上清液中内皮 素含量的影响，定量PCR技术研究VNP对低氧诱导的钠尿肚C型受体的调节。 2）以离体培养的新生大鼠CFs为研究对象，通过流式细胞仪观察CFS的细胞周 期，用＊．脯氨酸掺入实验测定胶原合成速率，放免法测定细胞内CGMP和。AMP， 定量PCR技术研究VNP对CFS的NPR．C的调控。 3）以离体培养的人IMA和SV的VSMCS为研究对象，通过MTT比色实验、 总蛋白质含量测定观察细胞的增殖，11JN EL染色观察细胞凋亡，钙敏感的荧光指示 剂结合共聚焦显微镜研究细胞内游离钙变化，对IMA和SV的VSMCS的增殖和凋亡 进行对比研究，为临床选择合适的血管进行搭桥手术和术后再狭窄的防治提供理论依 据。 一个 第四军医大学博士学位论文 结果和讨论： 1．重度低氧（2％－3％OZ）24 h，心肌细胞数和蛋白质合成均降低，并且培养液中 LDH水平增高，提示重度低氧有细胞毒性作用。相反，中度低氧（10％－12％O。）显著 增加蛋白质的合成，具有促心肌细胞肥大的作用。10“mol／LVNP降低重度低氧诱导的 LDH水平的增加，提示它可能对低氧诱导的细胞坏死有抑制作用，但VNP并不改善 细胞的活性，并且有显著促进细胞凋亡的作用；对中度低氧诱导的心肌细胞蛋白质的 合成增加，VNP有浓度依赖性抑制作用。VNP不影响心肌细胞内cAMP水平，但显 著升高心肌细胞内cGMP水平，降低低氧诱导的培养上清液中内皮素的含量。此外， VNP显著降低低氧诱导的钠尿肽 C受体的升高。结果提示：l）不同程度低氧对离体