生孢噬纤维菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌三元融合子构建及RAPD分析
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本研究将能杀灭部分寄生虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thudngie)、能净化水质、增强水产动物免疫力、促进鱼类生长的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili5)和分解纤维素的生孢噬纤维菌(Sporooytophaga myxococcoides),进行原生质体融合,希望得到具有三亲本优良特性于一体的益生菌。通过筛选最终得到一株具有产生芽孢、水解淀粉、降解纤维素,产生植酸酶的多功能融合子。主要结果如下:1.从土壤中分离纯化苏云金芽孢杆菌,并对物理生化特性进行鉴定。结果获得了一株产芽孢能力较强的苏云金芽孢杆菌菌株BS-12。2.分别对枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌的二元融合子BP-1和苏云金芽孢杆菌BS-12进行生长曲线测定,结果显示BS-12和BP-1对数生长中后期分别为6.0小时、7.0小时。3.利用单因素试验探讨影响苏云金芽孢杆菌BS-12和二元融合子BP-1原生质体的形成率和再生率的因素,结果显示葡萄糖、甘氨酸和青霉素能影响原生质体的形成和再生;BS-12、BP-1最佳溶菌酶浓度分别为6.0 mg/mL,5.0 mg/mL;最佳酶解时间分别为60分钟,60分钟。在最佳优化体系下,BS-12菌株的原生质体形成率和再生率分别82.7%,32.4%;二元融合子BP-1菌株为84.6%,34.6%。4.用热灭活的方法对苏云金杆菌BS-12原生质体进行灭活处理,用紫外线对二元融合菌株BP-1进行灭活处理,结果显示:BS-12原生质体在60℃下灭活时间25分钟,原生质体的死亡率为100%;BP-1原生质体用紫外灭活5min,死亡率达100%。5.在PEG6000和Ca2+存在下,立即将BS-12和BP-1的原生质体在37℃水浴箱中融合60min,再进行融合子筛选。在再生培养基上获得68株三元融合子,连续传代10代,获得一株较稳定的三元融合子FM-20-1。6.比较亲本及融合子菌落表型,显微形态,生化特性,酶活鉴定,对融合子进行初步鉴定。7.对三元融合子FM-20-1、二元融合子BP-1、苏云金杆菌BS-12、生孢噬纤维菌、枯草芽孢杆菌进行随机扩增DNA多态性(RAPD)分析,结果显示三元融合子FM-20-1跟BP-1、BS-12、生孢噬纤维菌和枯草芽孢杆菌都有共同的条带,其遗传距离FM-20-1跟BP-1最近。
中文摘要 | 第8-10页 |
英文摘要 | 第10-11页 |
第一章 前言 | 第12-24页 |
1.研究目的和意义 | 第12-13页 |
2.微生态制剂的国内外研究现状及在水产上的开发利用 | 第13-17页 |
2.1 微生态制剂的国内外研究现状 | 第13-15页 |
2.2 微生态制剂在水产养殖上的应用 | 第15-17页 |
3.苏云金芽孢杆菌的研究现状 | 第17-19页 |
4.灭活原生质体融合技术的研究概况 | 第19-24页 |
第二章 苏云金芽孢杆菌的分离纯化和筛选 | 第24-30页 |
1 材料与方法 | 第24-26页 |
1.1 培养基 | 第24-25页 |
1.2 土样 | 第25页 |
1.3 方法 | 第25-26页 |
2.结果与分析 | 第26-29页 |
2.1 菌株分离结果 | 第26-27页 |
2.2 培养特性 | 第27-28页 |
2.3 不同蛋白胨与蔗糖含量及CaCO3加入对菌体生长与芽孢形成的测定 | 第28-29页 |
3.讨论 | 第29-30页 |
第三章 三元融合子的构建方法与条件 | 第30-43页 |
1 材料与方法 | 第30-32页 |
2.方法 | 第32-34页 |
2.1 菌种培养 | 第32页 |
2.2 两亲本菌株生长曲线的测定 | 第32页 |
2.3 原生质体的制备 | 第32-33页 |
2.4 原生质体灭活 | 第33页 |
2.5 原生质体的融合及再生 | 第33页 |
2.6 融合子的检出 | 第33页 |
2.7 原生质体形成率、再生率和融合率的计算 | 第33-34页 |
3 结果与分析 | 第34-39页 |
3.1 二元融合子BP-1和苏云金芽孢杆菌BS-12对数生长期的选择 | 第34页 |
3.2 葡萄糖、甘氨酸、青霉素对原生质体形成率和再生率的影响 | 第34-36页 |
3.3 溶菌酶浓度和酶解时间与原生质体形成的关系 | 第36-37页 |
3.4 原生质体灭活时间和温度的选择 | 第37-38页 |
3.5 原生质体融合及融合子的检出 | 第38-39页 |
4 讨论 | 第39-43页 |
4.1 培养基 | 第39-40页 |
4.2 菌体的对数生长期 | 第40页 |
4.3 制备预处理及制备液的组成 | 第40页 |
4.4 酶浓度 | 第40-41页 |
4.5 酶解温度及pH值 | 第41页 |
4.6 酶解时间 | 第41页 |
4.7 渗透压稳定剂 | 第41页 |
4.8 原生质体的保存对再生的影响 | 第41-42页 |
4.9 PEG的分子量及浓度 | 第42页 |
4.10 PEG处理的时间及温度 | 第42页 |
4.11 处理后培养时间及方式 | 第42-43页 |
第四章 融合子的生物学特性研究 | 第43-50页 |
1.实验方法 | 第43-46页 |
1.1 菌株形态学观察 | 第43-44页 |
1.2 融合子及亲本菌株的生理生化特性鉴定 | 第44-46页 |
2.结果与分析 | 第46-49页 |
2.1 融合子的形态特征 | 第46-48页 |
2.2 融合子的生理生化特征 | 第48-49页 |
3.讨论 | 第49-50页 |
第五章 节融合子及亲本菌株的RAPD分析 | 第50-64页 |
1.材料 | 第50-53页 |
1.1 实验菌种 | 第50页 |
1.2 主要试剂和药品 | 第50页 |
1.3 主要仪器设备 | 第50-51页 |
1.4 主要耗材 | 第51页 |
1.5 主要试剂配制 | 第51-53页 |
2.实验方法 | 第53-55页 |
2.1 菌种DNA的抽提 | 第53页 |
2.2 菌种基因组DNA的检测 | 第53-54页 |
2.3 数据统计析 | 第54-55页 |
3.结果与分析 | 第55-61页 |
3.1 三元融合子、二元融合子与其三种亲本菌种的DNA图谱 | 第55页 |
3.2 三元融合子、二元融合子与其三种菌种的遗传配型分析 | 第55-61页 |
4.讨论 | 第61-64页 |
4.1 关于RAPD-PCR反应体系与条件的优化 | 第61-62页 |
4.2 关于RAPD技术及融合子和亲本菌株的遗传关系分析 | 第62-64页 |
结论和后续工作 | 第64-66页 |
参考文献 | 第66-74页 |
致谢 | 第74-75页 |
作者简介 | 第75-76页 |
英文缩写符号说明 | 第76页 |
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