生孢噬纤维菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌三元融合子构建及RAPD分析

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本研究将能杀灭部分寄生虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thudngie)、能净化水质、增强水产动物免疫力、促进鱼类生长的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili5)和分解纤维素的生孢噬纤维菌(Sporooytophaga myxococcoides),进行原生质体融合,希望得到具有三亲本优良特性于一体的益生菌。通过筛选最终得到一株具有产生芽孢、水解淀粉、降解纤维素,产生植酸酶的多功能融合子。主要结果如下:1.从土壤中分离纯化苏云金芽孢杆菌,并对物理生化特性进行鉴定。结果获得了一株产芽孢能力较强的苏云金芽孢杆菌菌株BS-12。2.分别对枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌的二元融合子BP-1和苏云金芽孢杆菌BS-12进行生长曲线测定,结果显示BS-12和BP-1对数生长中后期分别为6.0小时、7.0小时。3.利用单因素试验探讨影响苏云金芽孢杆菌BS-12和二元融合子BP-1原生质体的形成率和再生率的因素,结果显示葡萄糖、甘氨酸和青霉素能影响原生质体的形成和再生;BS-12、BP-1最佳溶菌酶浓度分别为6.0 mg/mL,5.0 mg/mL;最佳酶解时间分别为60分钟,60分钟。在最佳优化体系下,BS-12菌株的原生质体形成率和再生率分别82.7%,32.4%;二元融合子BP-1菌株为84.6%,34.6%。4.用热灭活的方法对苏云金杆菌BS-12原生质体进行灭活处理,用紫外线对二元融合菌株BP-1进行灭活处理,结果显示:BS-12原生质体在60℃下灭活时间25分钟,原生质体的死亡率为100%;BP-1原生质体用紫外灭活5min,死亡率达100%。5.在PEG6000和Ca2+存在下,立即将BS-12和BP-1的原生质体在37℃水浴箱中融合60min,再进行融合子筛选。在再生培养基上获得68株三元融合子,连续传代10代,获得一株较稳定的三元融合子FM-20-1。6.比较亲本及融合子菌落表型,显微形态,生化特性,酶活鉴定,对融合子进行初步鉴定。7.对三元融合子FM-20-1、二元融合子BP-1、苏云金杆菌BS-12、生孢噬纤维菌、枯草芽孢杆菌进行随机扩增DNA多态性(RAPD)分析,结果显示三元融合子FM-20-1跟BP-1、BS-12、生孢噬纤维菌和枯草芽孢杆菌都有共同的条带,其遗传距离FM-20-1跟BP-1最近。
中文摘要第8-10页
英文摘要第10-11页
第一章 前言第12-24页
    1.研究目的和意义第12-13页
    2.微生态制剂的国内外研究现状及在水产上的开发利用第13-17页
        2.1 微生态制剂的国内外研究现状第13-15页
        2.2 微生态制剂在水产养殖上的应用第15-17页
    3.苏云金芽孢杆菌的研究现状第17-19页
    4.灭活原生质体融合技术的研究概况第19-24页
第二章 苏云金芽孢杆菌的分离纯化和筛选第24-30页
    1 材料与方法第24-26页
        1.1 培养基第24-25页
        1.2 土样第25页
        1.3 方法第25-26页
    2.结果与分析第26-29页
        2.1 菌株分离结果第26-27页
        2.2 培养特性第27-28页
        2.3 不同蛋白胨与蔗糖含量及CaCO3加入对菌体生长与芽孢形成的测定第28-29页
    3.讨论第29-30页
第三章 三元融合子的构建方法与条件第30-43页
    1 材料与方法第30-32页
    2.方法第32-34页
        2.1 菌种培养第32页
        2.2 两亲本菌株生长曲线的测定第32页
        2.3 原生质体的制备第32-33页
        2.4 原生质体灭活第33页
        2.5 原生质体的融合及再生第33页
        2.6 融合子的检出第33页
        2.7 原生质体形成率、再生率和融合率的计算第33-34页
    3 结果与分析第34-39页
        3.1 二元融合子BP-1和苏云金芽孢杆菌BS-12对数生长期的选择第34页
        3.2 葡萄糖、甘氨酸、青霉素对原生质体形成率和再生率的影响第34-36页
        3.3 溶菌酶浓度和酶解时间与原生质体形成的关系第36-37页
        3.4 原生质体灭活时间和温度的选择第37-38页
        3.5 原生质体融合及融合子的检出第38-39页
    4 讨论第39-43页
        4.1 培养基第39-40页
        4.2 菌体的对数生长期第40页
        4.3 制备预处理及制备液的组成第40页
        4.4 酶浓度第40-41页
        4.5 酶解温度及pH值第41页
        4.6 酶解时间第41页
        4.7 渗透压稳定剂第41页
        4.8 原生质体的保存对再生的影响第41-42页
        4.9 PEG的分子量及浓度第42页
        4.10 PEG处理的时间及温度第42页
        4.11 处理后培养时间及方式第42-43页
第四章 融合子的生物学特性研究第43-50页
    1.实验方法第43-46页
        1.1 菌株形态学观察第43-44页
        1.2 融合子及亲本菌株的生理生化特性鉴定第44-46页
    2.结果与分析第46-49页
        2.1 融合子的形态特征第46-48页
        2.2 融合子的生理生化特征第48-49页
    3.讨论第49-50页
第五章 节融合子及亲本菌株的RAPD分析第50-64页
    1.材料第50-53页
        1.1 实验菌种第50页
        1.2 主要试剂和药品第50页
        1.3 主要仪器设备第50-51页
        1.4 主要耗材第51页
        1.5 主要试剂配制第51-53页
    2.实验方法第53-55页
        2.1 菌种DNA的抽提第53页
        2.2 菌种基因组DNA的检测第53-54页
        2.3 数据统计析第54-55页
    3.结果与分析第55-61页
        3.1 三元融合子、二元融合子与其三种亲本菌种的DNA图谱第55页
        3.2 三元融合子、二元融合子与其三种菌种的遗传配型分析第55-61页
    4.讨论第61-64页
        4.1 关于RAPD-PCR反应体系与条件的优化第61-62页
        4.2 关于RAPD技术及融合子和亲本菌株的遗传关系分析第62-64页
结论和后续工作第64-66页
参考文献第66-74页
致谢第74-75页
作者简介第75-76页
英文缩写符号说明第76页
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