固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖工艺研究

龙胆低聚糖（gentio-oligosaccharides）是一类新型的功能性低聚糖，具有显著增殖肠内有益菌、调节肠内菌群平衡和改善通便效果等生理功能。为了降低龙胆低聚糖的生产成本，为其工业化生产提供技术参数，本文研究了固定化β-葡萄糖苷酶（IBGL）制备龙胆低聚糖的工艺，通过葡聚糖凝胶柱层析分离得到了目的物，并采用电喷雾质谱和核磁共振氢谱对其进行了鉴定。主要研究结果如下：1. BGL的制备工艺：黑曲霉固态发酵，按料液比1:10，自然环境温度下用pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液浸提3次，浸提率可达93.82%；硫酸铵两步盐析法纯化BGL，纯化倍数为1.6倍。2. IBGL的制备工艺：质量分数为3.5%的海藻酸钠水溶液10mL与2mL适度稀释的酶液充分混合（加酶量为105U/g干载体），加入1%（v/v）的戊二醛，4℃交联3h，滴入2%的氯化钙溶液中硬化12h，所得IBGL凝胶球的酶活为17.78U/g湿凝胶，硬度为658.32g，本工艺的酶活回收率为66.34%。3. IBGL的性质：IBGL的最适反应pH为4.8，最适反应温度为65℃，米氏常数Km值为1.07mmol/L。BGL和IBGL对葡萄糖的转化率分别为47%、43%。与BGL相比，IBGL的耐受pH范围、最适温度和稳定性都有所提高。4. IBGL固定床反应制备龙胆低聚糖工艺：60%（w/v）的葡萄糖缓冲溶液，加酶量为30U/g葡萄糖，pH4.8，温度65℃，转化36h，间歇反应4次。平均葡萄糖的转化率为41.07%，IBGL的剩余酶活为82.23%。IBGL的生产能力约为BGL的3.50倍。5.产物龙胆低聚糖的分离鉴定：1)分离条件：葡聚糖Shephadex G-10凝胶柱Φ1cm×40cm，10%乙醇洗脱，流速10mL/h，柱温50℃。产物经分离后得到了两个组份，TLC鉴定组份Ⅰ为葡萄糖，组份Ⅱ可能为生成的龙胆二糖。2)组份Ⅱ鉴定：ESI-MS测定其相对分子质量与龙胆二糖相同；1H-NMR（400MHz，D2O） δ：5.06，5.05，3.853.65，3.603.50，3.383.25，3.203.00。结合质谱、核磁共振氢谱结果，判定组份Ⅱ为龙胆二糖。6.酶法合成龙胆低聚糖体系中残留底物葡萄糖量的方法学研究：为定量测定酶法合成龙胆低聚糖得率，本文采用葡萄糖试剂盒法，通过测定转化后残留底物葡萄糖的量，间接测定龙胆低聚糖得率。该法在2小时内测定酶法合成龙胆低聚糖体系中葡萄糖量的结果稳定（RSD=0.81%），重复性好（RSD=0.97%），精密度高（RSD=1.55%），干扰小（加样回收率=101.68%）。7.成本分析：BGL制备龙胆低聚糖的总成本是IBGL的2.8倍，IBGL能显著降低龙胆低聚糖的生产成本。