胃肠功能失调或胃肠道器质性病变可引起胃肠痉挛。当胃肠痉挛所致的疼痛为功能性时,应使用调节肠管运动的药物,临床上常见的有抗胆碱药和钙离子通道阻断药,如阿托品或硝苯地平等。传统的抗胆碱药由于其不良反应较大在临床应用中受到一定的限制,钙通道阻断剂硝苯地平长期使用也可引起负性肌力和负性传导作用,因此开发具有安全、高效、低残留的抗胆碱类或钙通道阻断性的药物迫在眉睫。血根碱(sanguinarine, SA),为苯菲啶异喹啉类生物碱,主要存在于蓝堇科、罂粟科和芸香科的植物中。近年来,血根碱被应用于治疗胃肠道疾病,包括腹痛,腹泻或肠道炎症。研究表明,血根碱添加到仔猪饲料中,可有效防治仔猪腹泻,提高仔猪饲料转化率和日增重。但关于血根碱抑制胃肠运动、缓解胃肠痉挛的作用机理研究甚少,因此本文采用细胞生物学,分子生物学和免疫荧光等技术系统研究SA对大鼠肠平滑肌细胞(Intestinal smooth muscle cells, ISMC)收缩的抑制作用及信号传导通路的影响。主要研究内容和结果为：1.离体肠实验,取大鼠的十二指肠组织,应用生物机能分析系统记录血根碱对正常及工具药(乙酰胆碱、组胺、CaCl2)作用下肠平滑肌收缩的频率和振幅；并应用阻断剂(阿托品、异丙嗪及硝苯地平)作用后,血根碱对肠平滑肌的作用。结果表明,血根碱浓度依赖性的抑制了肠平滑肌活动的频率和振幅,对频率的半数抑制浓度(the concentrations to inhibit contractions by50%),IC50=28.31μM,对振幅的IC50=11.37μM；对由乙酰胆碱、组胺、CaCl2引起的肠平滑肌收缩的频率和振幅有明显的抑制作用,其频率的IC50分别为：25.14μM、28.33μM、27.90μM；其对振幅的IC50分别为：13.77μM、14.72μM、3.35μM。血根碱可增强阿托品对M受体、异丙嗪对H1受体及硝苯地平对Ica-L的阻断作用。因此,血根碱对肠平滑肌活动的抑制作用可能与M受体、H1受体及Ica-L有关。2.应用酶消化法分离并培养大鼠原代ISMC,经免疫组化鉴定后进行细胞收缩反应试验,利用倒置相差显微镜测定SA及对照药阿托品对大鼠肠平滑肌细胞长度的影响,并应用乙酰胆碱、组胺和KCl诱导ISMC(?)缩后,血根碱对细胞长度的影响。结果表明,血根碱对大鼠肠平滑肌细胞的自发性收缩有直接抑制作用,且对由乙酰胆碱、组胺和KCl诱导的ISMC收缩具有明显的抑制作用。同时,血根碱与阿托品具有协同作用,两者同时应用可显著抑制肠平滑肌细胞的收缩。3. ISMC与不同浓度SA作用24h后,应用实时荧光定量PCR(real-time reverse transcription PCR, RT-PCR)技术,测定SA对大鼠肠平滑肌细胞M2和M3受体基因表达的影响。结果表明：M2R和M3R在ISMC中均有特异性表达,且M2R表达量较高。通过RT-PCR分析,SA可显著下调大鼠ISMC M2R和M3R的基因表达水平。4.经钙离子荧光探针Fura-2/AM标记ISMC后,再应用SA及工具药KC1和卡巴胆碱(carbachol, CCh)作用细胞,通过荧光分光光度计测定SA对白发性及KCl或CCh诱导细胞内钙离子浓度升高后的影响。结果显示：SA可浓度依赖性抑制静息状态下ISMC内钙离子的浓度(P<0.05),在有钙环境下,SA可显著抑制由KC1或CCh诱导的ISMC内钙离子浓度的升高,但在无钙细胞外液中,SA对KCl或CCh作用后的细胞内钙离子浓度无影响。表明,SA对细胞外钙离子内流有明显的抑制作用,对内钙释放无影响。5.采用RT-PCR和蛋白免疫印迹杂交(Western-bolt, WB)方法检测SA对大鼠ISMC中PKC亚型及CPI-17基因和蛋白表达的影响。PKC(δ、ε、η)及CPI-17在大鼠ISMC中均可高效表达。CCh(10μM,10min)可显著上调ISMC PKCs和PKCη mRNA表达,CCh(100μM,60min)可明显诱导ISMC PKC (δ、η)和CPI-17基因表达水平(P<0.05)。μM和3μM的SA作用细胞30min可显著下调ISMC PKC(δ、ε、η)及CPI-17基因表达水平；SA(1μM,30min)对CCh(100μM,60min)诱导的ISMC PKC(δ、η)和CPI-17的基因表达具有显著下调作用。1μM的SA作用ISMC30min可显著下调ISMC PKCδ的蛋白表达水平,作用24h时,明显下调CPI-17的蛋白表达水平。同时,SA可显著下调CCh诱导的ISMC PKCδ和CPI-17的蛋白表达水平。因此,SA对ISMC PKC亚型和CPI-17的基因和蛋白表达均具有明显的抑制作用。综上所述,本课题以调控胃肠平滑肌兴奋-收缩偶联的PKC-CPI-17信号传导通路的研究为中心,应用荧光标记技术、RT-PCR和Western blot技术,阐明了SA对大鼠肠平滑肌细胞的抑制作用机制。其研究结果证明,SA对大鼠ISMC收缩的抑制作用与调控平滑肌细胞收缩的M受体、细胞内钙离子浓度及PKC-CPI-17信号传导通路的改变有关。
