纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用

纳豆激酶论文 固体发酵论文 盐析法论文 超滤法论文 速溶性论文
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2002年卫生部将纳豆作为普通食品进行管理,纳豆中的有效成分纳豆激酶(Nattokinase,NK)对降低人体血液粘稠度有特殊疗效,目前市场上的NK产品主要从日本、台湾进口,虽然售价高达2000元/kg左右,但是仍然深受血粘稠患者的热捧,因此近年来NK产品研发已成为国内外研究的热门课题。本课题以从中国普通微生物菌种保藏中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center, CGMCC)购买的来源于美国的一支纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto, ID1.1086)为起始菌种,研究了纳豆激酶的发酵、提纯和应用等方面,主要研究内容包括以下5个方面。(1)纳豆的制备及其质量检测。通过对精选黄豆进行清洗、浸泡、沥水、蒸煮、冷却、接种、发酵、后熟等工艺制得纳豆,同时对其质量进行检测。检测结果表明,纳豆呈淡黄色,具有纳豆特有的滋气味,粘性强、拉丝状态好、豆粒软硬适宜,无肉眼可见杂质;纳豆含水量为57.4g/100g,氨基酸态氮(以氮计)为0.355g/100g,蛋白质为19.56g/100g。以上测定结果符合SB/T10528-2009《纳豆》对纳豆指标的各项要求。(2)NK固体发酵条件的研究。首先对影响NK活力的食盐加入量、大豆初始含水量、大豆蒸煮时间、菌体接种量、发酵时间、发酵温度和后熟时间等7个固体发酵条件进行了单因素实验,确定了每个因素的最佳值;其次通过预备试验确定了影响NK活力的关键因素,即:大豆初始含水量,大豆蒸煮时间,菌体接种量;并通过正交实验和验证实验,确定了最佳优化结果,即大豆初始含水量为50%,大豆蒸煮时间45min,菌体接种量为10%。(3)盐析法分离纯化NK的研究。采用硫酸铵作为盐析用盐,并绘制盐析曲线,根据盐析曲线,选择30%的硫酸铵饱和度沉淀杂蛋白,选择70%的硫酸铵饱和度沉淀NK,得到盐析法分离纯化结果为:比活力达到508.1IU/mg,纯化倍数为1.21,回收率达到92%。(4)超滤法分离纯化NK研究。根据NK分子量为27728的特性,选择截留分子量分别为30KD和10KD的超滤膜,将NK粗酶液首先通过截留分子量为30KD的超滤膜,再将其透过液通过截留分子量为10KD的超滤膜,收集中间分子量段的NK滤液;同时研究了操作压力、料液温度和料液pH值等三个超滤工艺参数对膜通量和NK含量的影响,并通过单因素试验和正交实验,得到了最佳优化结果,即操作压力为0.25Mpa,料液温度为37℃,料液pH值为7.0。根据超滤工艺参数优化结果,得到超滤法分离纯化NK结果为:比活力达到1052.4IU/mg,纯化倍数为2.50,回收率达到81%,与硫酸铵盐析法分离纯化NK相比较,虽回收率有所下降,但NK的纯化倍数得到很大提高,且纯化步骤简单、纯化条件温和,减少了NK的损失。(5)山楂速溶纳豆粉的研制。采用冷冻干燥法制备纳豆粉及纳豆激酶粉,其冻干条件为:冻干温度为-54℃,真空度为0.08mbar。将纳豆粉、山楂粉、麦芽糊精、黄原胶等原辅料经过100目筛、混合、调配和包装等工艺制得山楂速溶纳豆粉,在单因素实验的基础上,以感官评价为评分标准,采用L9(3~4)正交实验和极差分析得到山楂速溶纳豆粉最佳配方及工艺条件为:纳豆粉与山楂粉质量比为1:0.3,麦芽糊精添加量为20%,黄原胶添加量为0.3%,冲调温度为60℃,此工艺条件下山楂果香浓郁、速溶性好且无分层现象。
摘要第5-7页
ABSTRACT第7-8页
目录第9-13页
1 前言第13-24页
    1.1 纳豆的定义及起源第13页
        1.1.1 纳豆的定义第13页
        1.1.2 纳豆的起源及发展第13页
    1.2 纳豆的食疗价值第13-15页
        1.2.1 纳豆的营养价值第13-14页
        1.2.2 纳豆与豆豉比较第14-15页
        1.2.3 纳豆的食用及医疗功效第15页
    1.3 纳豆的生产工艺第15-17页
        1.3.1 纳豆的生产原辅料第15-16页
        1.3.2 纳豆的生产菌种第16页
        1.3.3 纳豆的生产标准第16-17页
    1.4 纳豆的生产现状及开发前景第17-19页
        1.4.1 纳豆的生产现状第17-19页
        1.4.2 纳豆的开发前景第19页
    1.5 纳豆激酶简介第19-21页
        1.5.1 纳豆激酶的发现及定义第19页
        1.5.2 纳豆激酶的生化特性第19-20页
        1.5.3 纳豆激酶的溶栓机制第20页
        1.5.4 纳豆激酶酶活的检测方法第20-21页
    1.6 纳豆激酶的分离纯化及制备第21-22页
        1.6.1 纳豆激酶的发酵生产第21-22页
        1.6.2 纳豆激酶的分离纯化第22页
    1.7 纳豆激酶产品研发现状及开发前景第22-23页
        1.7.1 国内外纳豆激酶产品研发现状第22-23页
        1.7.2 纳豆激酶产品开发前景第23页
    1.8 本课题的主要目的、意义和研究内容第23-24页
2 纳豆激酶固体发酵条件的研究第24-43页
    2.1 引言第24页
        2.1.1 纳豆激酶固体发酵及其优势第24页
        2.1.2 纳豆激酶固体发酵条件优化第24页
    2.2 材料与仪器第24-26页
        2.2.1 材料与试剂第24-25页
        2.2.2 主要仪器与设备第25页
        2.2.3 菌种第25页
        2.2.4 培养基第25-26页
    2.3 实验方法第26-32页
        2.3.1 冻干菌株的恢复培养第26页
        2.3.2 纳豆芽孢杆菌的鉴定第26页
        2.3.3 菌体生长曲线的绘制第26页
        2.3.4 纳豆的制备第26-27页
        2.3.5 纳豆品质测定指标第27-28页
        2.3.6 纳豆激酶酶活测定法的确定第28-30页
        2.3.7 纳豆激酶固体发酵条件的优化第30-32页
    2.4 实验结果与分析第32-41页
        2.4.1 纳豆芽孢杆菌的鉴定第32-33页
        2.4.2 菌体生长曲线的绘制第33页
        2.4.3 纳豆品质测定指标第33-34页
        2.4.4 纳豆激酶酶活测定方法的确定第34-36页
        2.4.5 纳豆激酶的固体发酵条件的优化第36-41页
    2.5 小结第41-43页
        2.5.1 纳豆指标测定结果第41-42页
        2.5.2 纳豆激酶酶活测定方法的确定第42页
        2.5.3 NK 固体发酵条件的优化结果第42-43页
3 纳豆激酶分离纯化条件的研究第43-56页
    3.1 引言第43页
        3.1.1 纳豆分离纯化第43页
        3.1.2 纳豆激酶制备第43页
    3.2 材料与仪器第43-44页
        3.2.1 材料与试剂第43-44页
        3.2.2 主要仪器与设备第44页
    3.3 实验方法第44-49页
        3.3.1 NK 粗酶液的制备第44页
        3.3.2 NK 活力的测定方法第44页
        3.3.3 NK 含量的测定方法—考马斯亮蓝法第44-45页
        3.3.4 盐析法分离纯化 NK第45-46页
        3.3.5 超滤法分离纯化 NK第46-48页
        3.3.6 NK 的制备第48-49页
    3.4 实验结果与分析第49-54页
        3.4.1 NK 含量的测定方法第49页
        3.4.2 盐析法分离纯化 NK 结果分析第49-51页
        3.4.3 超滤法分离纯化 NK 结果分析第51-54页
    3.5 小结第54-56页
        3.5.1 盐析法分离纯化 NK 结果第54-55页
        3.5.2 超滤工艺正交实验优化结果第55页
        3.5.3 超滤法分离纯化 NK 结果第55-56页
4 山楂速溶纳豆粉的研制第56-66页
    4.1 引言第56页
    4.2 材料与仪器第56页
        4.2.1 材料第56页
        4.2.2 主要仪器与设备第56页
    4.3 实验方法第56-61页
        4.3.1 生产工艺第56-58页
        4.3.2 感官评价方法第58页
        4.3.3 检验方法第58-59页
        4.3.4 实验方案设计第59-61页
    4.4 实验结果与分析第61-65页
        4.4.1 单因素实验结果第61-63页
        4.4.2 正交实验结果第63-64页
        4.4.3 最佳配方的验证实验第64页
        4.4.4 山楂速溶纳豆粉的质量指标及测定结果第64-65页
    4.5 小结第65-66页
5 结论与展望第66-68页
    5.1 结论第66页
    5.2 展望第66-68页
致谢第68-69页
参考文献第69-74页
攻读学位期间发表的学术论文目录第74-75页
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