抗体亲和肽配基的理性设计和色谱表征

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开发快速高效的亲和配基理性设计方法对亲和色谱的应用推广具有十分重要的意义。本论文选择具有重要医药价值的免疫球蛋白G(IgG,抗体)为目标蛋白,开发了高亲和性肽配基的理性设计方法。首先结合分子对接和IgG亲和色谱建立了高通量筛选方法,获得了较高亲和性五肽EFYDD。实验证明此肽主要以静电作用结合IgG,与蛋白A(SpA)的差异很大,说明高通量筛选方法具有盲目性的缺点。针对高通量筛选的盲目性,本论文进一步提出了以SpA亲和配基为原型的仿生亲和肽配基理性设计方法。研究先采用全原子分子动力学模拟研究了SpA与IgG之间亲和作用的分子机理。模拟结果表明SpA结合IgG主要受疏水作用驱动,而静电作用主要调节SpA对不同Ig分子的选择性。此外,SpA与IgG的结合主要受热点残基的调控。基于SpA的热点残基和作用力构建了SpA亲和结合模型,为SpA仿生亲和肽配基的设计奠定了基础。其次,洗脱条件是影响亲和色谱纯化效率的重要因素,在此研究了盐和pH影响SpA与IgG之间相互作用的分子机理。盐主要影响SpA热点残基的疏水作用和静电作用,导致在SpA的螺旋I和螺旋II之间,以及疏水作用和静电作用之间存在相互补偿,从而使得盐对亲和力影响很小。在pH 3.0溶液中,SpA的热点残基H137,R146和K154与IgG相应残基间产生强静电排斥作用从而导致复合物的解离。故SpA的H137,R146和K154是复合物解离的分子基础。这些分子机理进一步完善了SpA的亲和结合模型。由于全原子分子动力学模拟的计算量太大,无法研究SpA与IgG相互作用过程中的变化。因此采用粗粒化分子动力学模拟研究了SpA-IgG复合物解离的全过程。在pH 3.0条件下复合物的解离过程可依次分为构象调整阶段,部分解离阶段,非特异性吸附阶段和完全解离阶段。且SpA的螺旋II上热点残基的作用首先被削弱,导致螺旋II先于螺旋I解离,进一步证明了螺旋II是SpA-IgG复合物解离的分子基础。模拟结果表明该方法是一种有效研究蛋白复合物亲和作用的分子动力学方法,可用于配基的理性设计。最后基于以上分子机理设计并筛选了SpA仿生亲和肽配基。首先根据SpA亲和结合模型理性设计了一个包含28000个多肽的仿生库。然后结合两次分子对接和粗粒化分子动力学筛选得到三个候选七肽。最后,利用亲和色谱实验验证候选多肽的亲和性,获得了与IgG具有高亲和性的七肽YFDWRWE。
摘要第3-4页
ABSTRACT第4-5页
第一章 文献综述第9-36页
    1.1 前言第9-10页
    1.2 亲和色谱和亲和配基第10-12页
    1.3 亲和配基的筛选技术第12-15页
        1.3.1 组合化学合成肽库筛选第12-13页
        1.3.2 噬菌体展示肽库筛选第13-14页
        1.3.3 核糖体展示肽库筛选第14-15页
    1.4 计算机辅助设计亲和配基第15-29页
        1.4.1 药效团模型第16-19页
        1.4.2 分子对接第19-22页
        1.4.3 分子动力学和自由能计算第22-26页
        1.4.4 从头设计第26-29页
    1.5 亲和配基的理性设计策略第29-31页
    1.6 亲和色谱法纯化抗体第31-34页
        1.6.1 抗体的结构,来源和重要意义第31-32页
        1.6.2 常见的抗体亲和配基第32页
        1.6.3 新型抗体亲和配基第32-34页
    1.7 本文的研究目的和内容第34-36页
第二章 亲和肽配基高通量筛选方法的建立和色谱表征第36-51页
    2.1 前言第36-37页
    2.2 实验材料与方法第37-41页
        2.2.1 分子模拟部分第37-38页
        2.2.2 实验部分第38-41页
    2.3 结果与讨论第41-50页
        2.3.1 分子对接初筛多肽第41-42页
        2.3.2 IgG 亲和介质的合成第42-44页
        2.3.3 IgG 亲和色谱复筛多肽第44-47页
        2.3.4 亲和肽配基EFYDD 的亲和色谱表征第47-50页
    2.4 小结第50-51页
第三章 蛋白A 与免疫球蛋白亲和作用的分子机理解析第51-69页
    3.1 前言第51-52页
    3.2 模型和方法第52-54页
        3.2.1 模拟体系第52-53页
        3.2.2 分子动力学模拟第53页
        3.2.3 结合自由能计算第53-54页
        3.2.4 自由能分解第54页
    3.3 结果和讨论第54-68页
        3.3.1 三个SpA-Ig 复合物的结合自由能计算第54-57页
        3.3.2 SpA-hIgG1 复合物中SpA 的自由能分解第57-59页
        3.3.3 SpA-hIgG1 复合物中hIgG1 的自由能分解第59-60页
        3.3.4 SpA-hIgG1 复合物的残基作用对分析第60-62页
        3.3.5 SpA-hIgG1 复合物的热点残基第62-64页
        3.3.6 SpA 选择性的分子机理第64-67页
        3.3.7 SpA 的亲和结合模型第67-68页
    3.4 小结第68-69页
第四章 盐和pH 对蛋白A 与人免疫球蛋白G1 亲和作用影响:分子动力学模拟第69-85页
    4.1 前言第69页
    4.2 模型和方法第69-71页
        4.2.1 模拟体系第69-70页
        4.2.2 分子动力学模拟第70-71页
        4.2.3 结合自由能计算第71页
        4.2.4 自由能分解第71页
    4.3 结果和讨论第71-84页
        4.3.1 盐对SpA-hIgG1 复合物的影响第72-76页
        4.3.2 0.5 M NaCl 溶液对SpA 热点残基的影响第76-77页
        4.3.3 1.0 M NaCl 溶液对SpA 的热点残基的影响第77-79页
        4.3.4 2.0 M NaCl 溶液对SpA 的热点残基的影响第79-80页
        4.3.5 pH 对SpA-hIgG1 复合物的影响第80-84页
        4.3.6 SpA 亲和结合模型的改进第84页
    4.4 小结第84-85页
第五章 粗粒化分子动力学模拟研究蛋白A-免疫球蛋白G 复合物的结合和解离第85-99页
    5.1 前言第85页
    5.2 模型和方法第85-87页
        5.2.1 模拟体系第85-86页
        5.2.2 粗粒化分子动力学模拟第86-87页
    5.3 结果和讨论第87-98页
        5.3.1 CG-MD 研究SpA-hIgG1 复合物的可行性第87-88页
        5.3.2 SpA-hIgG1 复合物的结合第88-93页
        5.3.3 SpA-hIgG1 复合物的解离第93-98页
    5.4 小结第98-99页
第六章 蛋白A 仿生亲和肽配基的理性设计和色谱表征第99-115页
    6.1 前言第99页
    6.2 实验材料与方法第99-102页
        6.2.1 分子模拟部分第99-100页
        6.2.2 实验部分第100-102页
    6.3 结果与讨论第102-114页
        6.3.1 亲和肽配基的理性设计策略第102-103页
        6.3.2 多肽库的构建第103-104页
        6.3.3 分子对接初筛多肽第104-105页
        6.3.4 粗粒化分子动力学复筛多肽第105-107页
        6.3.5 亲和色谱实验筛选多肽第107-113页
        6.3.6 亲和肽配基的理性设计方法的评估第113-114页
    6.4 小结第114-115页
第七章 总结与展望第115-118页
    7.1 本文总结第115-116页
    7.2 创新点第116-117页
    7.3 建议与展望第117-118页
参考文献第118-131页
发表论文和参加科研情况说明第131-132页
致谢第132页
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