酵母对纤维素水解液中复合抑制剂耐受的系统分析与解耦

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纤维素预处理过程中产生的呋喃类、弱酸类和酚类化合物等对酵母的纤维素乙醇生产产生明显的协同抑制。发育能够耐受多种抑制剂的菌种,并深入剖析菌株与抑制剂之间复杂的相互作用关系,对优化纤维素乙醇工业生产是一个挑战。本研究通过紫外诱变结合驯化的方法获得一株能够同时耐受三种抑制剂的酵母菌株;并从转录、蛋白和代谢水平系统地比较分析原始酿酒酵母和耐受酵母对复合抑制剂响应机制的差异,简化复合抑制剂与酵母细胞之间的复杂关系。以酿酒酵母为出发菌种,通过紫外诱变结合驯化的方法筛选出的耐受菌株,在含1.3 g/L糠醛,0.5 g/L苯酚和5.3 g/L乙酸的高糖培养基中发酵培养,与原始酵母相比,延滞期由48 h缩短至4 h,生长速率提高了8.7倍、葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率均提高了3.3倍,糠醛转化时间由40 h减少到6 h,乙醇产量没有显著变化,为48.28 g/L,表现出很强的耐受能力。通过对三种抑制剂对细胞协同作用的代谢水平分析,发现乙酸对酵母细胞的胁迫作用最明显,而糠醛、苯酚则增强了乙酸对细胞的胁迫;耐受酵母在代谢方面表现出较强的耐受性,主要表现为氨基酸和碳代谢等受复合抑制剂的影响较小。蛋白水平研究表明复合抑制剂对酵母产生氧化胁迫和未折叠蛋白胁迫等,但原始和耐受酵母的应答机制不同;耐受酵母能通过胁迫响应和脱毒来自我保护,且通过较低的氨基酸和核苷酸代谢和较高能量代谢,使其本身具有更强的耐受能力,而原始酵母需要依赖糖酵解和糖异生产生更多能量以抵抗抑制剂的胁迫作用。在蛋白水平和代谢水平的研究都发现,复合抑制剂使酿酒酵母的蛋白降解增加,且诱发氧化胁迫,从而抑制细胞的生长和生产。对原始和耐受酵母在转录水平对复合抑制剂的响应进行分析,发现复合抑制剂使原始和耐受酵母中与RNA和蛋白合成相关的基因显著下调,参与电子传递和能量合成相关基因显著上调,说明复合抑制剂影响酵母的生物合成和能量代谢,细胞需要合成更多能量抵抗抑制剂的胁迫;另外,复合抑制剂导致原始酵母蛋白降解,诱发氧化脱毒,使细胞产生自噬。通过研究细胞膜磷脂对复合抑制剂的响应机制,发现磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)链长的变化是酵母细胞对复合抑制剂响应的一个重要方面;磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)在原始和耐受酵母中对复合抑制剂的响应差异最大。转录和磷脂水平的研究结果表明,复合抑制剂使酵母细胞PE转化为PC的步骤严重受阻,酵母细胞膜曲率增加、细胞膜孔径增大,使抑制剂更易进入胞内,对细胞产生抑制作用。
摘要第3-4页
ABSTRACT第4-5页
前言第10-11页
第一章 文献综述第11-26页
    1.1 纤维素乙醇生产中抑制剂的研究现状第11-13页
        1.1.1 抑制剂的产生第11页
        1.1.2 抑制剂对细胞的毒害作用第11-12页
        1.1.3 抑制剂的脱毒第12-13页
    1.2 耐受菌株的选育第13-14页
        1.2.1 诱变育种及定向进化第13-14页
        1.2.2 菌株的基因工程改造第14页
    1.3 系统生物学及其应用第14-23页
        1.3.1 转录组学在燃料乙醇生产中的研究与应用第16页
        1.3.2 蛋白组学在燃料乙醇生产中的研究与应用第16-17页
        1.3.3 酵母代谢组学的研究与应用第17-21页
        1.3.4 单一抑制剂对细胞胁迫的系统研究第21-22页
        1.3.5 系统生物技术在菌种改造中的作用第22-23页
    1.4 基于系统研究的信息抽提与解耦第23-24页
    1.5 本课题的研究意义和主要内容第24-26页
        1.5.1 研究意义第24页
        1.5.2 主要内容第24-26页
第二章 复合抑制剂(糠醛、苯酚和乙酸)耐受酵母的选育第26-38页
    2.1 引言第26页
    2.2 材料与方法第26-28页
        2.2.1 主要设备第26-27页
        2.2.2 主要试剂第27页
        2.2.3 菌种及来源第27页
        2.2.4 培养基及抑制剂第27页
        2.2.5 分析方法第27-28页
    2.3 紫外诱变及筛选方案第28-29页
        2.3.1 紫外诱变方案第28页
        2.3.2 筛选方案第28-29页
    2.4 发酵条件第29页
        2.4.1 种子培养第29页
        2.4.2 原始菌株与耐受菌株的发酵第29页
    2.5 结果与讨论第29-37页
        2.5.1 原始酵母和耐受酵母在低糖培养基中的生长和发酵性能比较第29-32页
        2.5.2 原始酵母和耐受酵母在高糖培养基中的生长和发酵性能比较第32-37页
    2.6 小结第37-38页
第三章 糠醛、苯酚和乙酸对酿酒酵母协同作用的代谢组学研究第38-55页
    3.1 引言第38-39页
    3.2 材料与方法第39-42页
        3.2.1 菌株与培养基第39页
        3.2.2 菌种培养第39页
        3.2.3 实验设计第39-40页
        3.2.4 葡萄糖、乙醇和糠醛的检测第40页
        3.2.5 小分子代谢物的提取及衍生化第40-41页
        3.2.6 小分子代谢物的检测第41-42页
        3.2.7 数据分析第42页
    3.3 结果与讨论第42-54页
        3.3.1 单一抑制剂与复合抑制剂对酵母生长和发酵的影响差异第42-45页
        3.3.2 单一抑制剂与复合抑制剂对原始菌株影响的统计学分析第45-49页
        3.3.3 糠醛、苯酚、乙酸对原始菌株的协同作用第49-51页
        3.3.4 糠醛、苯酚、乙酸对原始菌株的拮抗作用第51-54页
    3.4 小结第54-55页
第四章 复合抑制剂对酿酒酵母和耐受酵母影响的代谢组学研究第55-72页
    4.1 引言第55页
    4.2 材料与方法第55-57页
        4.2.1 菌株与培养方法第55-56页
        4.2.2 实验设计第56-57页
        4.2.3 小分子代谢物的提取及衍生化第57页
        4.2.4 代谢物的GC-TOF/MS 检测第57页
        4.2.5 数据分析第57页
    4.3 结果与讨论第57-71页
        4.3.1 原始酵母和复合抑制剂耐受酵母的代谢谱比较分析第57-60页
        4.3.2 原始酵母和耐受酵母的代谢差异分析第60-64页
        4.3.3 原始菌株和耐受菌株在代谢物水平对复合抑制剂的差异响应第64-71页
    4.4 小结第71-72页
第五章 复合抑制剂对酿酒酵母和耐受酵母影响的蛋白组学研究第72-100页
    5.1 引言第72页
    5.2 材料与方法第72-77页
        5.2.1 菌株及培养方法第72页
        5.2.2 实验设计第72-73页
        5.2.3 蛋白质提取和二维凝胶电泳第73-75页
        5.2.4 二维凝胶电泳蛋白图谱分析第75页
        5.2.5 蛋白点的酶解及MALDI-TOF/MS 鉴定第75-76页
        5.2.6 数据分析第76-77页
    5.3 结果第77-96页
        5.3.1 原始酵母和耐受酵母蛋白质表达图谱的差异分析第77-84页
        5.3.2 原始酵母和耐受酵母的差异表达蛋白分析第84-88页
        5.3.3 原始酵母和耐受酵母在蛋白水平对复合抑制剂的差异响应分析第88-96页
    5.4 讨论第96-98页
    5.5 小结第98-100页
第六章 复合抑制剂对酿酒酵母和耐受酵母影响的转录组学研究第100-112页
    6.1 引言第100页
    6.2 材料与方法第100-101页
        6.2.1 菌株及培养方法第100页
        6.2.2 实验设计第100-101页
        6.2.3 RNA 提取和芯片检测第101页
        6.2.4 数据处理第101页
    6.3 结果第101-109页
        6.3.1 原始酵母与耐受酵母转录表达谱的差异分析第101-102页
        6.3.2 电子传递及与膜相关的能量利用第102-106页
        6.3.3 蛋白降解第106-107页
        6.3.4 脱毒第107-108页
        6.3.5 生物合成第108-109页
    6.4 讨论第109-111页
    6.5 小结第111-112页
第七章 复合抑制剂对酿酒酵母和耐受酵母影响的磷脂组学研究第112-128页
    7.1 引言第112-113页
    7.2 材料与方法第113-115页
        7.2.1 菌株与培养基第113页
        7.2.2 实验设计第113页
        7.2.3 磷脂的提取第113-114页
        7.2.4 LC-MS/MS 检测第114页
        7.2.5 数据分析第114-115页
    7.3 结果与讨论第115-126页
        7.3.1 原始酵母和复合抑制剂耐受酵母的磷脂图谱比较分析第115-118页
        7.3.2 复合抑制剂对原始和耐受菌株磷脂影响的多元统计分析第118-122页
        7.3.3 酵母对复合抑制剂响应机制的磷脂和转录水平分析第122-126页
    7.4 小结第126-128页
第八章 结论与展望第128-131页
    8.1 结论第128-129页
    8.2 创新点第129-130页
    8.3 展望第130-131页
参考文献第131-145页
发表论文和参加科研情况说明第145-147页
附录第147-151页
致谢第151页
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