免疫耐受治疗颅脑创伤的基础和临床研究

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颅脑创伤后首先由暴力损伤脑屏障组织和脑组织,接着免疫系统被调动激活,造成继发性脑屏障及脑组织损伤。本项研究目的是通过阻断或干预免疫系统的继发性损害来达到治疗颅脑损伤的目的。一、颅脑创伤后蛛网膜颗粒通透性的实验研究目的:证实颅脑创伤后蛛网膜颗粒通透性增加。方法:颅脑创伤后,对各组进行寰枕膜穿刺,创伤组和对照组分别抽出脑脊液0.5ml,将10mg/ml亚甲蓝溶液0.5ml注入小脑延髓池。于C组(注射对照脑脊液组)和D组(注射创伤脑脊液组)分别抽出脑脊液1m1,将10m/ml亚甲蓝溶液0.5ml混入对照组脑脊液0.5ml注入C组小脑延髓池,10mg/ml亚甲蓝溶液0.5ml混入创伤组脑脊液0.5ml注入D组小脑延髓池。处理后第1天和第3天抽取各组实验兔耳缘静脉血2ml,离心取血浆备用,在固相萃取装置提取其中的亚甲蓝并测算出其浓度。ELISA法检测血浆中TNF-α浓度。结果:关于血清中亚甲蓝浓度及TNF-a浓度,创伤后较对照组明显增高;注射对照脑脊液组较对照组增高;注射创伤脑脊液组较注射对照脑脊液组显著增高;注射创伤脑脊液组与创伤组无明显区别。结论:颅脑创伤可以导致蛛网膜颗粒通透性增强,但除暴力本身外,继发的炎性反应发生了更大的作用。二、口服免疫耐受治疗颅脑损伤的实验和临床研究目的:通过口服自身脑脊液诱发口服免疫耐受,并观察其治疗颅脑创伤的作用。方法:制作兔颅脑创伤模型后,各组于第0-7日取小脑延髓池脑脊液1ml,A组再注回小脑延髓池;B组将脑脊液丢弃;C组将脑脊液1ml白胃管内注入大白兔胃内;D组创伤后给予后足垫注射完全弗氏佐刹50ug,将脑脊液1ml自胃管内注入大白兔胃内。所有实验兔于第1,3,7,14,21天抽取耳缘静脉血2ml,离心去血清待测,并于21天处死取脑,4%多聚甲醛固定备用。用ELISA法测血清中IL-1、IFN-γ、IL-10、TGF-β和抗脑抗体浓度。周围血细胞计数。免疫组化染色观察谷氨酸表达情况;HE染色观察神经元变化。90例患者随机平均分为三组,于第2-7日每日晨起行要椎穿刺,取4ml脑脊液送化验检测蛋白含量。a组立即拔针;b组继续放出脑脊液10ml弃去不用;c组继续放出脑脊液10ml,脑脊液经鼻小肠管喂饲患者。伤后第1、3、7、14、21天晨起空腹抽取静脉血4ml,检测抗脑抗体浓度。结果:脑脊液引流组(B组)、口服脑脊液组(C组)、和免疫佐剂组(D组)中IL-1、IFN-γ、抗脑抗体浓度及周围白细胞计数较对照组降低(P<0.05),其中C组降低最多;而IL-10和TGF-p浓度较对照组升高(P<0.05),C组升高最多。C组谷氨酸表达和神经元退行性变最少,B组和D组居中。临床试验中,c组(口服脑脊液组)抗脑抗体水平和脑脊液蛋白含量最低,b组(脑脊液引流组)居中,均低于对照组(P<0.05)。结论:创伤后脑脊液蛋白含量增多,脑脊液引流可以减少抗原释放,从而减少脑组织免疫损伤;口服脑脊液可以诱导出免疫耐受,减少免疫损伤;完全弗氏佐剂可以部分抑制口服免疫耐受。脑脊液引流及口服脑脊液对颅脑损伤具有治疗作用。三、细胞疗法诱导免疫耐受治疗颅脑损伤的实验研究目的:观察未成熟树突状细胞及脐带间充质干细胞在颅脑创伤后的免疫调节作用。方法:制作兔颅脑创伤模型后,B组用选用5代脐带间充质干细胞107于伤后第1,2,3天予以耳缘静脉注射,;C组取未成熟树突状细胞107于伤后第1,2,3天注射入患兔耳缘静脉;A组作创伤对照组。均于并于伤后第1,3,7,14、21天采取耳缘静脉血4ml,离心取血清备用。用ELISA法测血清中IL-1、IFN-γ、IL-10、TGF-β和抗脑抗体浓度。结果:干细胞组(B组)和树突状细胞组(C组)中IL-1.IFN-γ、抗脑抗体浓度及周围白细胞计数较对照组降低(P<0.05),而IL-10和TGF-β浓度较对照组升高(P<0.05)。结论:未成熟树突状细胞和干细胞的静脉注射均可以诱导颅脑创伤后的免疫耐受,减轻免疫反应,对继发颅脑损伤具有治疗作用。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-7页
缩略语/符号说明第12-13页
前言第13-16页
    研究现状、成果第13-14页
    研究目的、方法第14-16页
一、颅脑创伤后蛛网膜颗粒通透性的实验研究第16-29页
    1.1 对象和方法第16-20页
        1.1.1 实验动物和分组第16页
        1.1.2 实验仪器第16-17页
        1.1.3 试剂第17页
        1.1.4 亚甲蓝标准曲线的建立第17页
        1.1.5 造模手术操作及准备第17-18页
        1.1.6 打击过程第18页
        1.1.7 小脑延髓池穿刺及注射亚甲蓝第18-19页
        1.1.8 测量血浆中亚甲蓝浓度第19页
        1.1.9 测量血浆中TNF-α浓度第19-20页
        1.1.10 统计方法第20页
    1.2 结果第20-26页
        1.2.1 血浆亚甲蓝浓度与吸光度标准曲线第20页
        1.2.2 各研究组内不同时间血浆亚甲蓝浓度比较第20-21页
        1.2.3 对照组与创伤组间血浆亚甲蓝浓度对照第21页
        1.2.4 对照组与注射对照脑脊液组血浆中亚甲蓝浓度对照第21-22页
        1.2.5 注射对照脑脊液组与注射创伤脑脊液组血浆中亚甲蓝浓度第22-23页
        1.2.6 各组血液中TNF-α浓度对照结果第23页
        1.2.7 对照组与创伤组血浆TNF-α浓度第23-24页
        1.2.8 对照组与注射对照脑脊液组血浆TNF-α浓度第24-25页
        1.2.9 注射对照脑脊液组与注射创伤脑脊液组血浆TNF-α浓度第25-26页
    1.3 讨论第26-28页
        1.3.1 蛛网膜颗粒结构及功能第26-27页
        1.3.2 创伤对蛛网膜颗粒的影响第27-28页
        1.3.3 TNF-α对蛛网膜颗粒的影响第28页
    1.4 小结第28-29页
二、口服免疫耐受治疗颅脑损伤的实验和临床研究第29-55页
    2.1 对象和方法第29-37页
        2.1.1 动物实验对象第29页
        2.1.2 实验仪器和试剂第29-30页
        2.1.3 造模手术操作及准备第30页
        2.1.4 打击过程第30页
        2.1.5 复苏后观察第30页
        2.1.6 脑脊液引流第30-31页
        2.1.7 炎性因子检测第31-33页
        2.1.8 兔周围血白细胞计数第33页
        2.1.9 预后评价第33页
        2.1.10 脑组织Glu表达的检测第33-34页
        2.1.11 HE染色第34页
        2.1.12 统计方法第34页
        2.1.13 临床实验对象第34-35页
        2.1.14 实验器材及试剂第35页
        2.1.15 操作治疗第35页
        2.1.16 抗脑抗体检测第35-36页
        2.1.17 测定脑脊液蛋白第36页
        2.1.18 GOS评分第36-37页
    2.2 结果第37-48页
        2.2.1 动物炎症因子实验结果第37-39页
        2.2.2 各动物实验组预后结果对照第39-43页
        2.2.3 各动物组脑组织谷氨酸表达第43-44页
        2.2.4 各动物组创伤周围组织神经元退行性变第44页
        2.2.5 各动物组周围血淋巴细胞计数第44-45页
        2.2.6 各组患者血清抗脑抗体浓度第45-46页
        2.2.7 脑脊液蛋白含量第46-47页
        2.2.8 患者周围血细胞计数第47页
        2.2.9 患者GOS评分结果第47-48页
    2.3 讨论第48-54页
        2.3.1 颅脑创伤后抗脑抗体的改变第48-49页
        2.3.2 脑脊液引流对创伤后免疫的影响第49-53页
        2.3.3 口服耐受的免疫调节第53-54页
        2.3.4 免疫治疗后脑组织谷氨酸表达的变化及神经元细胞退行性变第54页
    2.4 小结第54-55页
三、细胞疗法诱导免疫耐受治疗颅脑埙伤的实验研究第55-82页
    3.1 对象和方法第55-66页
        3.1.1 实验对象第55页
        3.1.2 实验仪器和试剂第55-56页
        3.1.3 未成熟树突状细胞分离培养及鉴定第56-57页
        3.1.4 脐带间充质干细胞的分离培养及诱导分化第57-61页
        3.1.5 造模手术操作及准备第61-62页
        3.1.6 打击过程第62页
        3.1.7 复苏后观察第62页
        3.1.8 细胞治疗第62页
        3.1.9 检测血清中炎性因子第62-64页
        3.1.10 周围血白细胞计数第64页
        3.1.11 预后评价第64页
        3.1.12 脑组织Glu表达的检测第64-65页
        3.1.13 HE染色第65-66页
        3.1.14 统计方法第66页
    3.2 结果第66-77页
        3.2.1 DC细胞表面标志物的检测第66页
        3.2.2 脐带间充质干细胞研究结果第66-71页
        3.2.3 各组炎性因子结果第71-76页
        3.2.4 各组周围血白细胞计数第76页
        3.2.5 各组脑组织谷氨酸表达第76-77页
        3.2.6 各组神经元细胞退行性变第77页
    3.3 讨论第77-81页
        3.3.1 未成熟树突状细胞的鉴定第77-78页
        3.3.2 脐带间充质干细胞的鉴定第78页
        3.3.3 树突状细胞对免疫耐受的影响第78-79页
        3.3.4 脐带间充质细胞对免疫耐受的影响第79-81页
    3.4 小结第81-82页
全文结论第82-83页
论文创新点第83-84页
参考文献第84-93页
发表论文和参加科研情况说明第93-94页
综述 临床免疫耐受疗法的研究进展第94-106页
    综述参考文献第100-106页
致谢第106页
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