玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEA)是一种非甾体雌激素样作用的霉菌毒素,它广泛存在于世界各地谷类食品中。ZEA具有生殖毒性、遗传毒性和免疫毒性等。然而关于ZEA暴露对雄性动物睾丸间质细胞(Leydig cells)凋亡和自噬的研究报道较少,为探究ZEA雄性生殖毒性的机理,本实验以分离的大鼠原代睾丸间质细胞建立模型,对ZEA在体外诱导Leydig细胞凋亡与自噬、诱导凋亡的信号转导通路以及自噬与凋亡的关系进行了研究。主要研究内容如下：1.ZEA诱导Leydig细胞凋亡。以0,2.5,5,10,20μg/mL的ZEA处理原代Leydig细胞12h, MTT法检测ZEA抑制Leydig细胞的活力影响；Hochest33258染色和透射电镜观察细胞核形态的变化；Annexin V-FITC/PI双荧光染色法定量检测ZEA对Leydig细胞凋亡的变化。结果显示,不同浓度的ZEA处理Leydig细胞12h后,细胞活率极显著低于对照组(p<0.01);20μg/mL的ZEA处理后12h后,细胞核发生明显的固缩、染色质凝聚等凋亡特征；电子显微镜观察到ZEA处理的Leydig细胞发生染色质边缘化、浓染、核固缩以及包内出现空泡等现象；Annexin V-FITC/PI双荧光染色流式细胞术检测显示,与对照组比较,ZEA处理组凋亡率显著升高(p<0.05),随着ZEA剂量的增加,细胞凋亡率逐渐升高,呈现出一定的剂量依赖性关系。结果表明,ZEA可诱导Leydig细胞的凋亡、抑制Leydig细胞的生长,从而影响睾酮的分泌。2.ZEA诱导Leydig细胞凋亡信号转导通路。以0,2.5,5,10,20μg/mL的ZEA处理原代Leydig细胞12h, JC-1探针检测线粒体膜电位的变化情况；Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase以及PARP的表达变化；Western blot检测细胞色素c(cytochrome c,Cyt c)的释放情况。结果显示,不同浓度的ZEA处理Leydig细胞后,与对照组比较,线粒体膜电位显著降低(p<0.05),随ZEA染毒剂量的增加,线粒体膜电位显著降低,并呈现出一定的剂量依赖性关系；Western blot检测Bax与Bcl-2结果显示,ZEA处理Leydig细胞后能够分别上调Bax和下调Bcl-2蛋白表达,与对照组比较,在10μg/mL和20μg/mL的ZEA处理组中Bax/Bcl-2的比率明显增加(p<0.05)；不同浓度的ZEA处理Leydig细胞后,与对照组比,线粒体中的Cyt c表达量下降(p<0.05)并且细胞浆中的Cyt c表达上调；ZEA处理后,蛋白Capsase-3、Capsase-9和PAPR活化表达上调。结果表明,ZEA通过调控Bcl-2和Bax促使线粒体发生去极化,释放Cyt c至包浆激活线粒体途径,随后激活Caspase级联反应最终诱发凋亡发生。3.ZEA对Leydig细胞自噬的影响。以0,2.5,5,10μg/mL的ZEA处理原代Leydig细胞12h,采用免疫荧光与流式细胞术分析检测吖啶橙(Acridine orange, AO)染色后Leydig细胞中酸性囊泡的变化；Western blot检测自噬标志性蛋白LC3和Beclin-1的表达变化；采用免疫荧光和透射电镜分别观察LC3聚点现象和自噬泡的形成。结果显示,不同浓度的ZEA处理Leydig细胞12h后,与对照组比较,细胞中酸性囊泡数量显著增加(p<0.05); Western blot分析自噬标志性蛋白LC3和Beclin-1的表达变化显示,不同浓度的ZEA处理组LC3和Beclin-1蛋白表达量显著高于对照组(p<0.05)；免疫荧光观察LC3聚点现象,分析显示,ZEA处理Leydig细胞后出现明显聚点(p<0.05),电子显微镜观察到ZEA处理的Leydig细胞形成自噬泡等典型特征。结果表明,ZEA能够提高大鼠Leydig细胞的自噬水平。4.自噬在ZEA诱导Leydig细胞凋亡中的作用。ZEA联合自噬激活剂(rapamycin,RAP)和自噬抑制剂(chloroquine, CQ)处理Leydig细胞,Wstern blot检测RAP和CQ分别对自噬蛋白LC3的影响；Annexin V-FITC/PI双荧光染色流式细胞术检测Leydig细胞凋亡变化。结果显示,ZEA与RAP联合处理Leydig细胞后与对照组比较,LC3-Ⅱ蛋白表达明显上调(p<0.05), ZEA与CQ联合处理组与对照组比较,LC3-Ⅱ蛋白表达明显上调(p<0.05); Annexin V-FITC/PI双荧光染色流式细胞术检测结果显示,在ZEA诱导的自噬中,RAP能够极显著降低Leydig细胞的凋亡率(p<0.01),CQ能够极显著抑制Leydig细胞的凋亡率(p<0.01)。结果表明,在ZEA诱导Leydig细胞自噬过程中,RAP与CQ能分别激活自噬和抑制自噬。激活自噬能降低凋亡,抑制自噬能够促进凋亡,在ZEA诱导的凋亡事件中,自噬可能扮演保护细胞的角色。实验揭示了ZEA通过线粒体途径信号通路诱导大鼠Leydig细胞发生凋亡,从而抑制其生长的规律,同时发现ZEA能够提高Leydig细胞的自噬水平,自噬能够延迟凋亡的发生。
