杏鲍菇蛋白抗氧化活性、抗增殖活性及免疫调节活性研究

食用菌营养丰富,风味独特,营养价值高。近年来,从食用菌中分离出大量生理活性物质。食用菌具有物种多样性、易繁殖的特点,药用价值高。大量研究表明食用菌具有抗氧化,抗菌,抗肿瘤,降血脂,降血糖等生物活性。食用菌的生物活性物质中,研究较广泛的主要是食用菌多糖,多糖与食用菌细胞壁厚度和形态特性有关。除多糖外,食用菌中含有其它生理活性物质,如蛋白质,酚类物质,以及具有抗氧化性,抗增殖和免疫调节活性的其他代谢产物。食用菌中,杏鲍菇味道鲜美,药用价值高,已成为重要食用菌品种之一,国内外广泛种植和人工培育。然而,现有的文献和报道中,缺乏有关杏鲍菇蛋白的深入研究。本文主要针对杏鲍菇蛋白质进行了提取,纯化和鉴定实验,进一步测定了纯化杏鲍菇蛋白的体外抗氧化、抗肿瘤活性和免疫调节活性,并确定了杏鲍菇蛋白的细胞毒性。采用乙酸提取和硫酸铵沉淀法从杏鲍菇子实体中分离蛋白质,通过三步过柱分离法对杏鲍菇蛋白质进行纯化：DEAE纤维素-52,CM羧甲基纤维素-52和凝胶柱Superdex-75。采用快速蛋白质液相色谱(FPLC)对蛋白组分进行纯化,用高效凝胶渗透色谱(HPGPC),氢核磁共振(1H-NMR)和傅立叶变换红外光谱(FT-IR)对杏鲍菇纯蛋白(PEP)进行特征分析。结果表明,对PEP进行HPGPC的分析得到单一对称的尖峰。由高效凝胶渗透分析得到标准物质分子量与标准色谱保留时间正相关,PEP的高效凝胶渗透色谱的保留时间是7.49 min,由拟合方程得出PEP分子量约为63 kDa。PEP的FT-IR光谱显示其蛋白质的特征红外吸收峰在1654 cm-’(酰胺I,主要是与C=O健伸缩振动有关)和1577 cm-1(酰胺Ⅱ,主要来自N-H健结合)。在3300 cm-1处观察到宽强峰,同样在1154 cm-1和1038 cm-1也观察到峰形。已有研究发现酰胺Ⅰ带的峰值频率对应于蛋白质的α-螺旋二级结构,且主吸收带接近1655 cm-1,因此,PEP在1654 cm-1处的峰形表明PEP的次级结构为α-螺旋特征。NMR谱图表明在脂肪族区域3.9-4.5 ppm的多重信号对应于CH-O键,这主要是由于甘氨酸的α氢导致的。此外,在4.7 ppm的尖峰对应于N-H健,主要由于存在精氨酸导致的,而出现在4.9-5.7 ppm处较小的峰形对应于O-H键,主要由于存在丝氨酸导致的。因此,可得出PEP是主要由甘氨酸,丝氨酸和精氨酸三种氨基酸组成。基于高效凝胶渗透色谱,FT-IR和1H-NMR的分析,可得到蛋白PEP是分子量为63 kDa的均一组分,具有二级a-螺旋结构特征。通过测定总抗氧化能力,还原力,铁和铜金属离子螯合能力,DPPH活性能力,羟基和超氧阴离子自由基的清除能力,采用-胡萝卜素/亚油酸法,和TBARS法来评价PEP的抗氧化活性。结果表明,在浓度为60μg/mL, PEP的总抗氧化能力,还原力,铁和铜离子螯合能力,DPPH活性,羟基和超氧阴离子自由基的清除能力活性显著强于未处理对照组(P<0.05),活性大小为28.34±0.01,0.15±0.00,18.89±0.00,19.30±0.01,27.28±0.03和20.93±0.01%。同标准抗氧化物相比,PEP有显著清除活性离子能力(48.06±0.00%)和抑制-胡萝卜素漂白能力(55.80±0.00%)。PEP与对照组相比显著抑制脂类过氧化产物的形成(P<0.05)。在浓度为60μg/mL, PEP抑制脂类过氧化产物活性大小为43.41±0.01%,高于同浓度的标准抗氧化剂。结果表明PEP抗氧化活性高,可以用于食品补充剂和药剂的开发。通过采用肺癌细胞A549,胃腺癌细胞BGC-823,肝癌细胞HepG2和胃癌细胞HGC-27细胞对PEP的抗肿瘤活性进行评价,并采用MTT法,alamar blue (AB), trylan blue (TB),中性红(NR),乳酸脱氢酶释放(LDH), FITC-Annexin V/PI双染法和细胞形态学分析方法用于检测PEP抑制肿瘤细胞增殖活性。选用紫杉醇,阿霉素和丝裂霉素C等传统癌症药物作为阳性对照。结果表明,PEP对不同器官上的肿瘤细胞(A549,BGC-823, HepG2和HGC-27)表现出显著地剂量依赖效应,PEP对A549, BGC-823和HepG2的抑制肿瘤增殖活性IC5α值分别为229.0±1.2,41.2±1.1和36.5±0.8 μg/mL,表明PEP显著抑制肿瘤细胞的增殖(P<0.05). PEP对HGC-27癌细胞作用效果不显著。在肿瘤细胞中,溶酶体容易与PEP发生反应,导致NR结果较高。NR结果表明当PEP浓度为320 μg/mL时,HepG2细胞存活率为23.12±1.15%。因此,杏鲍菇蛋白可作为有效的抗肿瘤剂。采用巨噬细胞RAW 264.7研究PEP的免疫调节活性。通过FITC-Annexin V/PI双染法,细胞形态分析,一氧化氮(NO)和过氧化氢释放,溶酶体酶的活性和胞饮作用法检测PEP免疫调节活性和细胞毒性。结果表明,当PEP浓度在160 μg/mL时,MTT, AB和TB法分别测得对RAW 264.7巨噬细胞增殖率提高12.9±1.5,17.35±2.76和20.83±1.84%,说明在此浓度下PEP能够显著刺激巨噬细胞的增殖(P<0.05),研究证实了蛋白PEP对激活巨噬细胞介导的免疫应答呈现剂量依赖效应,表明PEP能够通过巨噬细胞介导的免疫应答起免疫调节作用,可作为有效的免疫调节剂。本文采用Chang氏肝细胞株系研究PEP对正常细胞的影响。结果表明,表明蛋白PEP与对照组相比对人正常细胞没有显著毒性作用(P<0.05)。由于PEP具有较高的免疫调节活性,同时对正常细胞具有低毒性,因此可应用于免疫调节剂的开发,具有巨大的潜力。