细胞色素P450是人体内外源化合物清除的最重要的酶,负责药物的代谢,致癌物及有毒化合的清除等,赋予肝脏解毒的功能。CYP2D6是细胞色素P450超家族中最具有多态性的CYP酶。CYP2D6多态性的遗传分子基础已经得到阐明,CYP2D6基因的多态性——基因的缺失,重复,单核甘酸多态性（SNP）等是其多态性主要的分子基础。基因的多态性导致CYP2D6表型的多样性,不同个体代谢CYP2D6的底物的能力表现出明显的差异,从弱代谢者（PMs）到超快代谢者（UMs）,普遍存在于高加索人群和东方人群中。不同个体对药物代谢能力的差异导致个体在服用相同剂量的药物的治疗效果存在不均匀性（HTE）。CYP450介导的药物-药物相互作用（DDI）是目前临床用药安全中一个重要因素,为了避免联合用药中的DDI,各个研究机构做了大量的体外和临床的研究工作。CYP2D6的遗传多态性及其在药物代谢中所占的比重,使其在药物-药物相互作用研究中成为重要的研究对象。目前已经得到明确鉴定的CYP2D6等位基因突变体超过50种,其中CYP2D6*2,CYP2D6*10和CYP2D6*17是最为重要的三个等位基因突变体。CYP2D6*2导致两个氨基酸替换（R296C和S486T）,在高加索人群中的分布频率高达27.1～32.4%。CYP2D6*10含有两个错义突变导致两个氨基酸替换（P34S,S486T）,在东方人群中的分布频率达40.8～49.5%。CYP2D6*17含有三个氨基酸替换位点（T107I,R296C和S486T）在非洲黑人和美洲黑人中的分布频率高达15～34%。为了研究这这三个等位基因上的SNPs导致的单个氨基酸替换对等位基因酶在药物代谢和DDI中的影响,通过定点突变PCR,以CYP2D6*1（野生型）cDNA为模板,构建了四个单位点突变体:P34S,T107I,R296C和S486T及三个等位基因突变体CYP2D6*2（双突变体）,CYP2D6*10（双突变体）和CYP2D6*17（三突变体）。CYP2D6*1cDNA和各个突变体的cDNA整合进pYES2/CT载体,在酿酒酵母表达系统中诱导表达,通过差速离心法制备酵母微粒体酶,Western鉴定CYP2D6酶的表达,一氧化碳差示光谱法对CYP2D6酶进行定量。分别以荧光底物AMMC和药物探针底物丁呋洛尔对CYP2D6*1及各个突变株进酶动力学分析,求得米氏常数。最后再以荧光高通量和HPLC两种检测方法对23种药物对CYP2D6*1及各个突变体进行体外的药物抑制筛选实验。在本实验中,CYP2D6*1转化AMMC形成AMHC和氧化丁呋洛尔生成1-羟-丁呋洛尔的Vmax分别为31.14pmol/min/mg和175.31pmol/min/mg。四个单位点突变体中的P34S转化AMMC和丁呋洛尔的Vmax降低到CYP2D6*1的36.97-51.44%和14.85-23.43%,而T107I、R296C和S486T三个单点突变体转化AMMC和丁呋洛尔的Vmax和CYP2D6*1相当。CYP2D6*2转化AMMC和丁呋洛尔的Vmax和CYP2D6*1相当,R296C和S486T两个氨基酸的单独替换和组合都对CYP2D6酶活性没有影响。CYP2D6*10转化AMMC和丁呋洛尔的Vmax和CYP2D6*1相比降低到16.13～32.25%和10.28～12.57%,P34S单氨基酸位点的替换是CYP2D6*10酶活性降低的主要因素,S486T对CYP2D6*10的酶活性的降低贡献很小。CYP2D6*17转化AMMC和丁呋洛尔的Vmax降低到CYP2D6*1的49.35～51.61%和41.14～58.85%,T107I、R296C和S486T单位点突变对CYP2D6酶的活性没有影响,而三个位点的组合却使CYP2D6*17的酶活性显著降低。用荧光高通量方法和药物探针底物加HPLC的传统筛选方法对CYP2D6*1及其突变体同23种药物在体外进行药物抑制实验,同一种药物对CYP2D6*1和CYP2D6*2,CYP2D6*10,CYP2D6*17的抑制程度没有表现出明显的差异。而不同种的药物对CYP2D6酶的抑制能力表现出明显的差异,其中奎尼丁作为CYP2D6的特异性抑制剂,和其他药物相比,其对CYP2D6各酶的IC50值最小,抑制能力最强。以抗精神病药物为例,对CYP2D6酶活性抑制能力的排序为:硫利哒秦＞氯丙秦＞阿米替林;在抗抑郁药中药物抑制能力的顺序为:氟西汀＞氯米帕明＞舍曲林。hCYP-荧光和rhCYP-药物探针底物两种方法对药物进行筛查,对这两种方法所得到的IC50值进行相关性分析,R值达到了0.9824,相关性很好。
