色素上皮源性因子治疗糖尿病视网膜病变的机理研究

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目的:糖尿病是一种常见病和多发病,已成为世界范围的威胁人类健康的疾病。每年约有数以百万糖尿病患者因其并发症而致残或死亡,导致严重的社会和经济负担。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常见眼部微血管并发症,也是致盲的重要眼病之一。因此如何早期预防和诊治,减少DR的发生,降低致盲率,已成为世人尤以关注的社会问题。DR最主要的病理改变是新生血管形成。研究表明新生血管形成是多种血管生成因子和抑制因子相互拮抗协同作用的结果,其中色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)被认为是“天然的新生血管抑制物”。PEDF是目前发现的最强大的新生血管抑制因子,其在糖尿病视网膜病变发病机制中具有重要的作用。本研究通过建立1型糖尿病SD大鼠模型,观察玻璃体内注射PEDF对早期糖尿病视网膜病变的防治作用,探讨PEDF在糖尿病视网膜病变的发生、发展中的作用及其机制。方法:选取8周龄的健康雄性SD大鼠40只,体重200-220g,随机分为4组:正常对照组(CON组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病PEDF注射组(DM+PEDF组)和糖尿病生理盐水注射组(DM+NS组),每组10只。组间大鼠体重无统计学差异。实验期间各组大鼠常规饲料喂养。适应性喂养5天后,糖尿病组大鼠禁食12小时后左下腹腔给予链脲佐菌素( STZ,0.1mmol/L,柠檬酸钠配制,pH4.5)65mg/kg注射。注射后48小时选取尾静脉测血糖≥16.8mmol/L作为1型糖尿病动物模型。糖尿病模型建立后,正常对照组和DM组不做任何处理,DM+PEDF组在糖尿病模型建立后1周和2周时分别向玻璃体腔内注射PEDF 2ug/8ul,而DM+NS组注射同样体积的生理盐水。于糖尿病模型建立后3周时处死动物,摘除眼球制作标本,进行组织病理学及电镜观察。在光学显微镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞细胞核数目,电镜下观察视网膜组织超微结构的改变。并采用免疫组化方法检测视网膜PEDF、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)、炎性相关因子-细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)以及细胞通透性相关因子-紧密连接蛋白1(zonula occludens 1,ZO-1)以及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)等在蛋白水平的表达。实验数据用x±SD(均数士标准差)表示,应用方差分析计算组间的差异。p<0.05认为有统计学差异, P<0.001被认为有显著统计学差异。结果:1糖尿病大鼠的成模率和死亡率30只大鼠接受STZ注射,28只成模,均为一次注射成模,成模率93.3%。DM+PEDF以及DM组分别有1只大鼠在试验中死亡。故糖尿病组大鼠死亡率为7.1%。2糖尿病大鼠体重以及血糖的变化。同CON组大鼠相比,糖尿病组大鼠,即DM、DM+NS,DM+PEDF组大鼠的血糖在整个实验过程均中明显升高,而三组接受不同处理的糖尿病组大鼠间血糖水平无统计学差异。同正常同龄对照组大鼠相比,糖尿病大鼠体重明显降低,且这种体重的差异有随着病程的延长而增加的趋势。3眼底表现同CON组大鼠相比,1型糖尿病程为3周的大鼠晶状体透明,眼底未见明显改变。4视网膜超微结构的变化:在透射电镜下,正常对照组大鼠视网膜神经节细胞结构清晰,细胞器结构完整,DM组大鼠视网膜可见神经节细胞水肿,线粒体肿胀变大,基质肿胀明显,可见大部分或全部的嵴消失,部分双侧膜融合,粗面内质网扩张。玻璃体内PEDF注射可以明显的改善这一病理改变,而玻璃体内注射生理盐水则无此作用。5视网膜PEDF与VEGF的表达变化在正常对照组与3周1型糖尿病病程的大鼠中,PEDF与VEGF的表达都很少,阳性细胞主要位于神经节细胞层、内核层等细胞中。各组间阳性细胞数无明显统计学差异。表明3周糖尿病的病程尚不能引起视网膜表达PEDF以及VEGF的变化,玻璃体内PEDF注射似乎可以增加PEDF的表达,减少VEGF的表达,但相对于DM以及DM+NS无明显统计学差异。6 PEDF干预可以减少炎性相关因子ICAM-1以及MCP-1的表达正常对照组大鼠视网膜中ICAM-1以及MCP-1表达极少,同正常对照组相比,3周糖尿病病程可以导致视网膜ICAM-1以及MCP-1的表达明显增加,玻璃体内PEDF注射可以明显减少ICAM-1以及MCP-1的表达,而注射NS则无此种作用。表明PEDF通过减少一些炎性因子的表达改善糖尿病视网膜病变的进展。7 PEDF干预可以增加视网膜细胞连接蛋白ZO-1以及相关因子Akt的表达在正常组大鼠视网膜中,ZO-1蛋白主要表达于内核层的细胞以及神经节细胞,糖尿病3周时ZO-1蛋白的表达明显减少,而PEDF注射能增加内核层以及神经节细胞的ZO-1蛋白的表达。在正常大鼠的视网膜中,Akt主要表达于内丛状层以及脉络膜的细胞浆中。糖尿病3周时内丛状层中的Akt较正常对照组明显减少,PEDF治疗可使糖尿病大鼠视网膜内丛状层中Akt表达增加。结论:1同正常对照组相比,糖尿病视网膜病变早期(3周病程)时视网膜VEGF以及PEDF均无表达变化;2糖尿病视网膜病变早期时已出现视网膜神经节细胞超微结构的改变,而PEDF治疗可以改善视网膜神经节细胞的损伤并有一定保护作用;3糖尿病视网膜病变早期时已出现视网膜炎性相关因子ICAM-1及MCP-1的表达增加,PEDF玻璃体内注射可以减少视网膜炎性相关因子的表达;4糖尿病视网膜病变早期时视网膜ZO-1以及Akt的表达明显减少,而PEDF玻璃体内注射可以增加细胞连接蛋白以及相关因子的表达。5以上结果表明PEDF可以明显的改善糖尿病视网膜病变早期时神经节细胞的损害,通过减少炎性因子和增加细胞连接蛋白而减轻血-视网膜屏障的破坏,从而对早期糖尿病视网膜病变起着一定的防治作用。
中文摘要第4-7页
英文摘要第7-9页
前言第11-12页
材料与方法第12-17页
结果第17-20页
附图第20-37页
附表第37-38页
讨论第38-42页
结论第42-43页
参考文献第43-47页
综述 PEDF与眼部疾病第47-63页
    参考文献第56-63页
致谢第63-64页
个人简历第64页
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