腈水解酶的制备、固定化及其应用研究

腈水解酶是一类重要的水解酶,它能够在相对温和的条件下催化腈类化合物生成相对应的羧酸或者酰胺类物质。与传统的有机化学合成方法的苛刻条件相比,如高压、高温、有毒重金属催化剂或者强碱,酶法催化合成由于其温和的反应条件和较高的转化率而在工业应用上受到关注。本论文以苯甘氨腈为底物,考察了腈水解酶的制备、氨基载体或者环氧载体的固定化以及固定化酶的潜在应用,分为以下三部分：1、底物苯甘氨腈的合成以及腈水解酶的制备。通过化学方法实现了底物苯甘氨腈的合成,同时底物稳定性的研究为后续的催化反应条件的确定提供了基础。通过对酶库中重组菌株产生的腈水解酶的研究,确定了以铜绿假单胞杆菌产生的腈水解酶为研究对象。同时通过试验确定了最佳的腈水解酶纯化工艺：采用Ni-NTA亲和层析纯化技术,最终得到了纯化的酶液。纯度检测：纯化后的腈水解酶在SDS-PAGE中显示为单一条带,从而确定了酶的纯度。2、纯化得到的腈水解酶酶学性质的考察：确定了纯化的腈水解酶的最适反应温度(40℃)和最适pH (pH=10.0),同时研究了腈水解酶的各种有机溶剂耐受性,为将来两相中催化底物反应以及减少底物降解建立理论基础。考虑到反应过程中需要添加助溶剂甲醇辅助底物溶解,实验同时确定了纯化的酶的最适的甲醇反应浓度(10%,v/v)。3、腈水解酶的固定化以及固定化酶的相关性质研究。以氨基和环氧两种载体作为固定化的材料,通过对固定化过程各种条件的优化,从而确定了腈水解酶以氨基和环氧为载体的最优的固定化参数。通过对两种不同载体的固定化酶的酶学性质研究表明：最适反应温度和pH以及热稳定性和pH稳定性都优于游离酶,此外,腈水解酶经过环氧载体固定化后,在pH=11.0的条件下具有较高的催化活性,而在此条件下,底物苯甘氨腈能够发生自消旋,结合第二章中结论(pH=11.0条件下,腈水解酶具有较高的立体选择性),酶经过环氧载体固定化后基本可以满足工业催化要求,固定化酶可以发挥较高的催化效率,生产构型单一产物。