水母毒素的分离纯化及蛋白质组学研究
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水母(Jellyfish)分布广、种类多、资源丰富。水母毒素主要分布于触手的刺丝囊细胞中,是一类结构新颖且具有多种生物活性的蛋白。但是,由于水母种类的不同,其毒素的结构、生物活性也存在一定的差异。本论文以近年来经常在我国近海区域大规模出现的霞水母(Cyanea sp.)和沙蜇(Stomolophus meleagris)为研究对象,研究水母毒素的提取制备方法、生物活性、分离纯化及其蛋白质组学分析等,主要结果如下:1.对水母毒素的提取制备方法进行了研究。以霞水母为研究对象,首先制备水母的刺丝囊细胞,然后采用组织研磨器Mini-beadbeater破碎刺丝囊细胞提取毒素,并且研究了提取过程中蛋白酶抑制剂对霞水母毒素溶血活性的影响,结果发现1mmol/LEDTA和4μg/mL PepstantinA能够有效地保护霞水母毒素的溶血活性。2.研究了水母毒素的溶血活性,并经纯化得到具有溶血活性的蛋白。霞水母和沙蜇毒素对鸡血红细胞均具有明显的溶血活性,其半溶血率HU50分别为10和10.5μg/mL;理化因素对溶血活性的影响中,温度的影响最敏感,在37℃时溶血活性最强,但是当温度超过45℃时,其溶血活性明显降低。采用离子交换层析(DEAE Sepharose Fast Flow)和凝胶过滤层析(Superdex75/200)等分离纯化方法,分别从霞水母和沙蜇毒素中分离到具有溶血活性蛋白CnPH和SmTX,其对鸡血红细胞的半溶血率HU50分别为5和70μg/mL。3.研究了水母毒素的体外抗氧化活性,并对沙蜇毒素的抗氧化活性蛋白进行分离纯化。结果表明,霞水母和沙蜇毒素对羟自由基(·OH)的半清除率EC50分别为200和500μg/mL,对超氧阴离子(O2-·)的半清除率EC50分别约为5.5和75μg/mL。利用硫酸铵分级沉淀和凝胶过滤(Superdex75)两种分离方法,从沙蜇毒素中分离到分子量为90kDa具有抗氧化活性的蛋白SmP90,该蛋白具有明显的清除超氧阴离子自由基(O2-·)的能力,其半清除率EC50约为16μg/mL,并且测定其N末端序列为:Asn-Leu-Asp-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Tyr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Gly-Gly。4.以沙蜇毒素蛋白为载体,利用Shotgun蛋白质组学方法首次对水母毒素的蛋白组成进行分析,共鉴定出181种蛋白。利用生物信息学方法将鉴定出来的蛋白质进行信息学分析,包括按照生物学进程、细胞组分及分子功能将其分别分为13、9和7类;并且从生物学通路里映射到33条相应的通路,在此基础上构建了基因网络来分析这些蛋白质可能存在的酶-酶、蛋白-蛋白以及基因表达之间的相互关系。通过本文的研究表明:霞水母和沙蜇毒素具有明显溶血活性和抗氧化活性,经过分离纯化,分别从霞水母和沙蜇毒素内分离到溶血活性蛋白CnPH和SmTX及抗氧化活性蛋白SmP90;并应用蛋白质组学方法分析了沙蜇刺丝囊细胞毒素蛋白,共鉴定出181种蛋白质并且利用生物信息学方法对其进行了统计分析。
致谢 | 第4-5页 |
摘要 | 第5-7页 |
ABSTRACT | 第7-9页 |
第一章 绪论 | 第12-45页 |
第一节 水母的生物学特征 | 第12-14页 |
1.1 霞水母(Cyanea sp.)的生物学特征 | 第12-13页 |
1.2 沙蜇(Stomolophus meleagris)的生物学特性 | 第13-14页 |
第二节 海洋生物毒素的研究进展 | 第14-30页 |
2.1 多肽类海洋生物毒素的研究 | 第14-22页 |
2.2 聚醚类海洋生物毒素的研究 | 第22-25页 |
2.3 生物碱类海洋生物毒素的研究 | 第25-30页 |
第三节 水母毒素的研究进展19 | 第30-42页 |
3.1 水母毒素提取制备 | 第31页 |
3.2 水母毒素的生物活性研究 | 第31-36页 |
3.3 水母毒素的分离纯化 | 第36-39页 |
3.4 水母毒素的结构鉴定 | 第39-42页 |
第四节 选题意义与研究内容 | 第42-45页 |
第二章 水母毒素的提取制备、活性测定及分离纯化与鉴定 | 第45-99页 |
第一节 水母毒素的提取与制备 | 第45-50页 |
1.实验材料 | 第45-46页 |
2 实验方法 | 第46-48页 |
3.结果与讨论 | 第48-50页 |
第二节 水母毒素溶血活性的测定及其影响因素 | 第50-56页 |
1 实验材料 | 第50-51页 |
2 实验方法 | 第51-52页 |
3 结果与讨论 | 第52-56页 |
第三节 霞水母毒素溶血活性蛋白的分离纯化 | 第56-70页 |
1 实验材料 | 第56-58页 |
2 实验方法 | 第58-64页 |
3 结果与讨论 | 第64-70页 |
第四节 沙蜇毒素溶血活性蛋白的分离纯化 | 第70-81页 |
1 实验材料 | 第70-72页 |
2 实验方法 | 第72-76页 |
3 结果与讨论 | 第76-81页 |
第五节 水母毒素的抗氧化活性研究及其分离纯化与鉴定 | 第81-99页 |
1 实验材料 | 第81-83页 |
2 实验方法 | 第83-89页 |
3 结果与讨论 | 第89-99页 |
第三章 水母毒素的蛋白质组学鉴定与生物信息学分析 | 第99-121页 |
第一节 水母毒素的 Shotgun 蛋白质组学研究 | 第101-112页 |
1 实验材料 | 第101-103页 |
2 实验方法 | 第103-104页 |
3、结果与讨论 | 第104-112页 |
第二节 水母毒素蛋白的生物信息学分析 | 第112-121页 |
1 水母毒素的生物信息分析方法 | 第112-114页 |
2 水母毒素的生物信息学分析结果 | 第114-121页 |
结论 | 第121-123页 |
创新点 | 第123-124页 |
参考文献 | 第124-136页 |
附录 | 第136-137页 |
作者简介 | 第137页 |
博士在读期间发表(或待发表)文章目录 | 第137-139页 |
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