HBx促进肝前体细胞的增殖和恶性转化

第一部分HBx促进肝前体细胞的增殖和恶性转化研究背景和目的肝前体细胞（hepatic progenitor cells，HPCs）是在慢性肝病患者肝脏中出现的一种具有多向分化潜能的原始细胞，被认为是肝脏内的一类干/祖细胞。临床和基础的大量研究表明，肝前体细胞与众多肝脏疾病有着密切的关系。在肝脏肿瘤的发生过程中，也常伴有肝前体细胞的增殖，而转化后的肝前体细胞在动物模型中可以诱导肝脏肿瘤的发生。由此众多学者认为肝前体细胞分化过程的异常可能是肝脏肿瘤发生中的重要事件，肝前体细胞与原发性肝癌关系非常密切。肝前体细胞的研究是近年来肝脏基础研究的热点。研究发现，肝前体细胞是一类存在于胆管和Hering管区的核圆少浆的上皮细胞。在肝前体细胞活化、增殖和分化的机制方面的研究，已取得一些进展。Wnt/β-catenin信号通路、转化生长因子(TGF-β)、IL-6、TWEAK等均与肝前体细胞的增殖和活化有关，但调控肝前体细胞增殖、恶性转化的机制及其与肝细胞癌发生之间的关系仍未阐释清楚。HBV感染与慢性病毒性肝炎、肝硬化以及肝细胞肝癌(HCC)的发生发展密切相关，是HCC的主要病因之一。HBV基因组中的非结构基因X基因编码的HBx蛋白，由154个氨基酸组成，分子量约17kDa，是HBV病毒重要的功能调控蛋白，与肝癌的发生、发展有密切联系，但其确切致病机理尚有待进一步阐明。另外，HBx对肝前体细胞增殖以及对其恶性转化后诱发肝癌的过程是否有调控作用，国内外尚未见报道。本课题将利用HBx转基因小鼠这一便捷的研究工具，全面系统地研究HBx对肝前体细胞的增殖、恶性转化等生物学特性的调控作用，并探索其作用机制，进一步探讨肝前体细胞诱发肝癌的机制，相关研究在国内外尚未见报道。而研究HBx对肝前体细胞的调控作用，将有助于进一步阐明HBx和肝前体细胞在肝癌发生过程中的重要意义，从而推动肝癌发病机制的基础研究，以期为肝癌的靶向治疗提供新依据。实验方法1、通过含0.1%DDC的饲料饲喂HBx转基因小鼠和同窝野生型对照小鼠（分别为实验组和对照组小鼠），建立肝前体细胞活化模型；饲喂起始时间均为小鼠出生后6-7周，短期诱导时间为1个月，长期诱导时间最长为7月，每月均取小鼠肝组织标本和血（提取血清成分冰冻保存）；2、用HE染色、免疫组织化学和免疫组织荧光等方法，比较DDC饲喂后两组小鼠肝前体细胞的增殖和活化情况，并用流式细胞仪检测两组小鼠原代肝前体细胞中EpCAM+的比例；3、通过体外培养原代肝前体细胞，研究两组小鼠肝前体细胞的生长情况；4、通过实时荧光定量PCR（Realtime PCR）和成球实验（Spheriod实验）分别比较两组小鼠肝前体细胞的干细胞基因表达、成球能力等干细胞样特性；5、在长期饲喂DDC后，观察不同时间点两组小鼠是否产生肝脏肿瘤；用HE染色、免疫组织化学荧光、免疫组化染色等方法鉴定所产生的肝脏肿瘤的性质；6、用磁珠分选的方法得到两组小鼠原代EpCAM+肝前体细胞，注射等量细胞到NOD/SCID鼠皮下，观察两组来源细胞是否形成肿瘤；用HE染色、免疫组织化学荧光、免疫组化染色等方法鉴定肿瘤的性质，并判断是否与DDC长期诱导产生的肝肿瘤性质一致；7、通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测DDC诱导不同时间点两组小鼠血清中IL-6的表达水平；通过蛋白质印迹(Western Blot)、免疫组织化学、定量PCR等方法，比较IL-6/Stat3和Wnt/β-catenin两条信号转导通路在两组小鼠肝脏中的活化情况；8、通过定量PCR检测，得到200例肝癌HBx的表达水平，然后计算中位数，从而将肝癌患者分为HBx高表达和低表达两组，同时通过免疫组织化学，检测肝癌标本的肝癌干细胞标志物的表达强度并分级，最后运用统计学方法，比较两组患者肝癌干细胞标志物表达以及临床病理指标有无统计学差异。结果1、在DDC诱导HBx组和野生型对照小鼠1个月和4个月后，HBx组小鼠的肝前体细胞增殖数量和活化程度高于对照组小鼠，并且HBx组小鼠的EpCAM+肝前体细胞较高，这表明HBx可以促进肝前体细胞的增殖和活化；2、HBx组小鼠来源的原代EpCAM+CD45肝前体细胞较对照组生长较快，并且形成的克隆较大；相对于野生型对照组小鼠，HBx组小鼠来源的原代EpCAM+CD45肝前体细胞的干细胞基因表达较高，成球能力较强；表明HBx可以促进肝前体细胞的干细胞样特性；3、DDC饲喂到7个月后，HBx转基因小鼠都发生肝脏肿瘤，并且肿瘤的性质为混合型肝癌（肝细胞癌和胆管细胞癌），而野生型对照组小鼠则没有发生肝肿瘤，表明HBx可以促进DDC诱导肝肿瘤的发生，同时提示HBx可能促进肝前体细胞的过度增殖并发生恶性转化，最终诱发肝癌；4、在DDC饲喂4月后， HBx转基因小鼠未发生肿瘤，但分离其原代EpCAM+CD45肝前体细胞并接种到NOD/SCID鼠皮下后，能形成具有肝细胞和胆管细胞双重成分的肿瘤，而对照小鼠来源的细胞则没有形成肿瘤；另外，DDC诱导4月后，HBx组小鼠来源的原代EpCAM+CD45肝前体细胞的癌细胞基因表达较高；以上表明HBx能促进肝前体细胞的过度增殖并发生恶性转化，最终诱发肝癌；5、DDC饲喂的不同时间点，HBx转基因小鼠肝脏中IL-6/STAT3信号通路的活化水平逐渐增高，并且均高于野生型对照组；表明HBx可能通过促进IL-6/STAT3信号通路的活化来调控肝前体细胞，促进其过度增殖并发生恶性转化；6、DDC饲喂的不同时间点，HBx转基因小鼠肝脏中Wnt/β-Catenin信号通路的活化水平逐渐增高，并且均高于野生型对照组；表明HBx可能通过促进Wnt/β-Catenin信号通路的活化来调控肝前体细胞，促进其过度增殖并发生恶性转化；7、HBx表达水平与肝癌标本中肝癌干细胞标志物的表达呈正相关，提示HBx也能促进肿瘤性肝前体细胞的增殖。结论在本研究中，通过对HBx转基因小鼠予以致癌剂1,4-二氢-3,5-吡啶二甲酸二乙酯（DDC）处理而诱导建立肝损伤模型，并分析HBx的表达和肝前体细胞的致肿瘤性之间的关系。与对照组小鼠相比，HBx转基因小鼠在DDC喂养1个月和4个月时观察到其肝内EpCAM+的肝前体细胞数量上升。在DDC喂养7个月后所有HBx转基因小鼠肝内均形成肝细胞癌(HCC)和胆管细胞癌混合型的肿瘤。值得注意的是，从DDC喂养4个月、尚未发生癌变的HBx转基因小鼠肝中分离出EpCAM+的肝前体细胞接种到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠皮下可形成混合细胞型肿瘤(4/6)，而从对照组中分离的肝前体细胞接种后则不能在NOD/SCID小鼠皮下致瘤，提示HBx可能诱导肝前体细胞的恶性转化并致瘤。我们同时发现，在HBx转基因小鼠体内有更高滴度的白细胞介素(IL)-6以及更高活化水平的IL-6/STAT3和Wnt/β-catenin信号转导通路，提示HBx可能通过上述通路诱导肝前体细胞发生内源性改变从而具有致肿瘤性的潜能。最后，临床证据显示在伴HBV感染的肝癌患者中，HBx的高表达与EpCAM+或OV6+肝癌干细胞数量呈正相关，并与肝癌的临床病理指标显著相关。第二部分自噬促进肝癌起始细胞的干细胞特性研究背景和目的肿瘤干细胞学说认为，癌症是起源于极少数肿瘤起始细胞，这类细胞具有自我更新、耐药性和成瘤性等特征，在肝癌的发生发展中发挥着重要的作用。近年来，许多研究报道肝癌起始细胞（Tumor initiating cells，T-ICs）能被一些生物标志物所鉴定，如CD133, EpCAM, CD90, OV6等。尽管越来越多的研究致力于肝癌起始细胞的研究，但调控肝癌起始细胞干细胞特性的具体机制仍未阐明。自噬是存在于真核生物中的一个非常保守的降解系统，它产生的自噬体可以捕获细胞浆内的物质，并将其转运到溶酶体。自噬可以被许多因素激活，如饥饿、高温、低氧、变性蛋白质的聚集等。调控自噬的所有成分中，最重要的就是自噬相关基因（Atg），它们最初在酵母菌中通过遗传筛选的方法被鉴定出来，是自噬通路中必需的成员。研究还表明，Atg8/LC3参与自噬体的形成，LC3被Atg4剪切后形成胞浆LC3-I,后者与磷脂共价结合形成膜相关的LC3-II。因此，LC3-II的水平与自噬泡形成的数量相关，它通常用来作为自噬形成的标志。自噬与许多肝脏疾病有关，如肝损伤，肝硬化和肝癌等。有报道认为抑制自噬可以促进肝癌的形成，但是也有许多研究表明自噬可以维持肝癌的肿瘤特性，另外，在肝癌发展中会出现局部肿瘤组织的缺氧或者营养供给缺乏，此时自噬可被激活从而促进肿瘤细胞的存活。近几年的研究表明，自噬与干细胞的生存和分化关系密切[23]。自噬与肿瘤起始细胞的关系都是近年来热点研究的领域，研究表明，自噬对于胚胎干细胞和造血干细胞特性的维持有着重要的作用。最近有报道认为自噬可以正向调控CD44+CD24-乳腺癌起始细胞的表型，也能提高胰腺癌起始细胞在低氧环境下的生存能力。除此之外，自噬还参与成体干细胞的自我更新和分化。尽管如此，目前仍然只有很少一部分研究致力于自噬与肿瘤起始细胞的关系。另外，许多研究表明肝癌起始细胞对于肝癌的发生发展也越来越受重视。因此，我们假设自噬可以调控肝癌起始细胞的干细胞特性。在本研究中，我们首先证实了自噬在肝癌细胞系的起始细胞中是激活的，接着我们证明了自噬可以促进肝癌起始细胞的干细胞基因表达增高，相反，抑制了自噬发生或者干扰自噬相关基因如beclin1或者Atg5，可以抑制肝癌起始细胞的干细胞特性，如成球能力、干细胞基因表达等。最后，我们证明了抑制自噬可以逆转由顺铂是富集的肝癌起始细胞比例。这不仅阐明了自噬与肝癌起始细胞的关系，还为肝癌起始细胞的调控机制提供了新依据，相关研究在国内外尚未见报道。实验方法1、用无血清spheriod悬浮培养和磁珠分选的方法富集肝癌起始细胞，用蛋白质印迹（Western Blot）、定量PCR检测肝癌起始细胞中自噬的表达情况，并进一步用电镜验证肝癌起始细胞中自噬表达的情况；2、用化学试剂3-MA和CQ抑制自噬，通过成球实验（spheroid）来验证肝癌起始细胞的成球能力是否被抑制，通过流式细胞仪检测肝癌起始细胞的比例是否降低，还通过定量PCR方法检测肝癌细胞系的干细胞基因有无降低；3、用SiRNA干扰自噬相关基因Atg5或者beclin1，用成球实验检验肝癌起始细胞的自我更新能力是否受抑制，通过定量PCR方法检测肝癌细胞系的干细胞基因有无被抑制，；4、顺铂刺激肝癌细胞，然后用蛋白质印迹、LC3点计数和电镜检测顺铂是否可以诱导自噬，再用定量PCR检测干细胞基因有无增加，并用流式细胞仪检测肝癌起始细胞比例是否增加；相反，用抑制剂抑制自噬，再用上述方法检测顺伯富集的肝癌起始细胞的比例是否下降。5、将MHCC-LM3接种到裸鼠皮下，然后将裸鼠分为4组，每组分别腹腔注射生理盐水，CQ，顺铂，顺铂加CQ。待6周后取下肿瘤标本。通过定量PCR检测干细胞基因的表达水平，免疫组织化学检测OV6的表达。结果1、在悬浮肿瘤球和磁珠分选两个富集肝癌起始细胞的模型中，相对于对照组，肝癌起始细胞的自噬表达水平较高，表现在LC3Ⅱ表达较高以及自噬相关基因表达较高，最重要的是，电镜检测也得到一致的结果；以上结果提示自噬在肝癌起始细胞中是高表达的；2、通过自噬抑制剂抑制自噬，与对照组相比，发现肝癌细胞的成球能力降低、干细胞基因表达降低、肝癌起始细胞的比例减少等，这表明抑制自噬可以负向调控肝癌起始细胞的干细胞特性；3、通过干扰自噬相关基因Atg5或者beclin1，发现肝癌细胞的成球能力降低、干细胞基因表达降低等，表明干扰自噬相关基因可以抑制肝癌起始细胞的干细胞特性；4、通过体外和体内实验均发现，顺铂可以诱导自噬的发生，并且它是通过激活自噬来提高肝癌起始细胞的比例；如果抑制自噬，就能降低顺铂富集的肝癌起始细胞的比例，这表明抑制自噬可以逆转化疗药物顺铂富集的肝癌起始细胞比例。结论本研究首次报道了自噬与肝癌起始细胞之间存在着密切的关系，并且证明了自噬可以促进肝癌起始细胞的干细胞特性，相反抑制自噬可以负调控其干细胞特性，而且，我们还证实了顺铂是通过激活自噬来富集肝癌起始细胞的，并且抑制自噬可以明显降低由顺铂富集的肝癌起始细胞的比例。这些结果不仅为肝癌起始细胞的调控机制提供了新依据，还为清除肝癌起始细胞提供了一个新靶点。