由于复杂和特殊的生存环境,海洋微生物在海洋环境中通常与其他生物形成共附生的关系,并形成一套化学防御系统以利于自身或宿主的生存,而所形成的化学防御物质大多具有生物活性,所以越来越多的科学家认为化学防御是海洋微生物产生活性物质的主要诱因。但海洋微生物化学防御是如何启动,即它的启动机制是什么,还鲜有研究。随着微生物学的发展,群体感应机制逐渐被揭示,有学者提出微生物,尤其是细菌中的化学防御机制是受到群体感应调控的假设。群体感应(quorum sensing)是细菌细胞根据自身和外源细菌所释放的特定信号分子浓度,以感知细胞数量变化,并进行基因表达的代谢调控现象。群体感应最重要的一个特点是密度依赖性,即当细菌密度较高时,细胞产生的自诱导信号分子(AI)浓度会积累到一个临界阈值,细菌感应到自诱导信号分子,从而表现出某些独特的生理特性,包括生物发光、抗生素的生物合成、毒性基因的表达及生物膜的形成等等。本论文所要解决的问题是探明海洋细菌化学防御物质的产生是否受到群体感应的调控。本文通过天然产物化学和化学生态学的方法,以一株具有显著抗菌活性且具有群体感应现象的海绵共栖细菌Pseudoalteromonas sp. NJ6-3-1为个案,以产生抗菌物质作为化学防御的响应,一方面鉴定了细菌NJ6-3-1产生的化学防御性物质,并证实细菌NJ6-3-1抗菌物质的产生具有密度依赖性,即抗菌物质的产生受到群体感应的调控,以此说明海绵共栖细菌NJ6-3-1存在由群体感应调控的化学防御;另一方面探明了海绵共栖细菌NJ6-3-1中存在着群体感应信号分子N-酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)和二酮哌嗪类化合物(DKPs),并对细菌NJ6-3-1中调控抗菌物质代谢的自诱导信号分子进行了探寻。最后通过对细菌NJ6-3-1进行全基因组测序的方法,在细菌NJ6-3-1中获得了群体感应转录调控蛋白LuxR的基因片段,从而从分子水平上初步证实了细菌NJ6-3-1中确实存在LuxI/LuxR调控的群体感应系统。本项研究将丰富海洋细菌化学防御诱导机制的相关理论,进一步加深对细菌群体感应调控功能的认识,并为开发新型药用天然产物提供新的思路。全文共分六章:第一章,分为两部分,首先介绍了海绵共栖微生物的研究概述,包括海绵共栖微生物的种类、次级代谢产物和化学防御机制;然后介绍了细菌群体感应系统的研究概况,包括群体感应的研究历史、目前发现的群体感应信息系统及信号分子的种类、群体感应系统的形成和调控机制及群体感应信号分子AHLs的检测方法、从而引出海洋细菌中的群体感应现象;在此基础上确定了本文的主要研究内容。第二章,主要研究了具有抗菌活性的海绵共栖细菌的筛选及鉴定。首先利用平板涂布法从南海和东海海绵生物样品中分离海绵共栖细菌,以4种致病菌作为实验用指示菌对海绵共栖细菌进行了抗菌活性筛选。同时采用16S rDNA同源性和系统发育分析对活性菌株进行种属鉴定和系统发生学研究。结果表明,在分离到的95株海绵共栖细菌中,19株(20 %)细菌具有抗菌活性。并且通过细菌分类鉴定,结果显示具有抗菌活性的细菌大部分属于芽孢杆菌属(Bacillus)。第三章,主要研究了海绵共栖细菌Pseudoalteromonas sp.NJ6-3-1抗菌物质产生的密度依赖性。本章第一节和第二节采用化学方法和生物技术相结合的方法,首先对具有显著抗菌活性的海绵共栖细菌NJ6-3-1的抗菌代谢产物进行分离纯化,通过活性跟踪,最终从细菌NJ6-3-1代谢产物中获得了2个抗菌物质,并结合各种结构鉴定的方法确定了化合物的结构。第一个抗菌物质分子式为C15H13BrO3,分子量为320,结构式命名为:2-(1’-溴-1’,3’-丁二烯)-4-(2”,4”-二烯戊酸)-苯酚。该化合物对枯草芽孢杆菌(BS)、金黄色葡萄球菌(SA)、酿酒酵母(SC)均有不同程度的抑菌作用,MIC分别为500μg/mL,125μg/mL和250μg/mL。第二个抗菌化合物分子量为520,分子式为C23H24BrN2SO5。该该化合物对金黄色葡萄球菌(SA)有抑菌作用,MIC为500μg/mL。本章第三节利用酶标仪和高效液相色谱及飞行时间质谱仪同时检测不同培养时间下细菌NJ6-3-1的细胞密度和NJ6-3-1代谢产物粗提液中抗菌物质C23H24BrN2SO5的量,从而确定了细菌NJ6-3-1抗菌物质C23H24BrN2SO5的量依赖于细菌的细胞密度。通过对不同培养时间下细菌NJ6-3-1代谢产物粗提液的抗菌活性检测,进一步证实了细菌NJ6-3-1抗菌物质的代谢具有密度依赖性,且细胞密度阈值为OD630=0.4。第四章,主要研究了海绵共栖细菌Pseudoalteromonas sp.NJ6-3-1代谢产物中的AHLs。本章第一节建立了一套检测细菌中群体感应信号分子AHLs的方法,并结合这些方法对海绵共栖细菌NJ6-3-1中AHLs的产生情况进行了检测。首先通过微生物传感菌A. tumefaciens A136检测,确定细菌NJ6-3-1中含有AHLs信号分子,能够诱导A136产生蓝色色素。再通过GC-MS检测确定细菌NJ6-3-1中含有N-己酰基高丝氨酸内酯(C6-HSL)、N-辛酰基高丝氨酸内酯(C8-HSL)和N-十四酰基高丝氨酸内酯(C14-HSL)三种AHLs信号分子。该方法还可用于大批量细菌中AHLs产生菌的筛选工作。本章第二节通过向低密度细菌NJ6-3-1中添加作为群体感应诱导信号分子的NJ6-3-1的自身代谢物C6-HSL、C8-HSL和C14-HSL的甲醇溶液,获得了添加不同诱导物后的NJ6-3-1代谢产物粗提液,通过生物自显影检测抗菌活性及HPLC检测抗菌物质C23H24BrN2SO5的代谢量,结果初步证实了C8-HSL能够诱导低密度细菌NJ6-3-1产生抗菌活性,并且能够诱导低密度细菌NJ6-3-1的抗菌物质C23H24BrN2SO5代谢量增加,由此我们推断C8-HSL很有可能就是细菌NJ6-3-1产生的调控抗菌物质代谢的自诱导信号分子。第五章,主要研究了海绵共栖细菌Pseudoalteromonas sp.NJ6-3-1代谢产物中的DKPs。首先通过向低密度细菌NJ6-3-1中添加可作为群体感应机制诱导信号分子的NJ6-3-1自身代谢物cyclo-(ΔVal-L-Val)、cyclo-(L-Phe-L-Val)、cyclo-(L -Pro-L-Leu) (简称为VV-2、VF-2、PL-2),获得了添加不同诱导物后的细菌NJ6-3-1代谢产物粗提液,通过生物自显影检测抗菌活性,结果初步证实VF-2能诱导低密度细菌NJ6-3-1产生抗菌活性,因此很有可能就是细菌NJ6-3-1产生的调控抗菌物质代谢的自诱导信号分子。其次,为了从海绵共栖细菌NJ6-3-1中得到更多的DKPs化合物,我们发酵100 L细菌NJ6-3-1菌液,并对细菌NJ6-3-1代谢产物中的DKPs化合物进行分离纯化,共得到12种DKPs化合物,后来通过理化性质及光谱学手段鉴定了DKPs的结构。并且其中1种DKPs化合物,即cyclo-(Tyr-Phe)至今还没有在微生物中发现的报道。第六章,初步研究了海绵共栖细菌Pseudoalteromonas sp.NJ6-3-1中群体感应的分子基础,对luxR基因片段进行了测序分析。通过对细菌NJ6-3-1进行SOLiD全基因组测序的方法(宁波大学工作),在细菌NJ6-3-1中获得了群体感应转录调控蛋白LuxR的基因片段,从而从分子水平上初步证实了细菌NJ6-3-1中存在LuxI/LuxR调控的群体感应系统。
