云南省GBV-C流行与进化特征及其自身清除机制的研究

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庚型肝炎病毒(GB virus C, GBV-C)发现于二十世纪九十年代中期,属于黄病毒科、单股正链RNA病毒,基因组全长约9.4kb。GBV-C与艾滋病病毒(HIV-1)、丙型肝炎病毒(HCV)具有几乎相同传播途径,在HIV/HCV单/共感染的静脉吸毒人群(IDUs)中广泛传播。根据基因序列同源性,目前GBV-C可分为六种基因型,各基因型具有典型的地域分布特征。GBV-C病毒感染者无典型的临床症状,但该病毒在与HIV-1共感染情况下,具有延缓艾滋病病程、抑制艾滋病病毒复制的作用,此作用与GBV-C基因型及相关基因序列特征具有较大的相关性。云南省地处我国西南边陲,与东南亚多国接壤,毗邻全球最大的毒品生产地——金三角地区,是毒品运输的重要途径。多项研究表明,血缘性病毒的传播途径和毒品运输路径直接相关,云南省因此成为HIV-1和HCV传入我国,并向其他省份传播的源头地区,在云南地区开展血缘传播病毒的分子流行病学研究显得尤为重要。在云南省开展开展GBV-C的分子流行病学,及在与HIV-1共感染情况下的疾病慢性化机制研究具有较大的科学意义和潜在应用价值。为调查云南地区GBV-C的感染情况,我们首先对该地区231例静脉吸毒者和非静脉吸毒者的GBV-C感染情况进行检测,发现GBV-C E2抗体检测阳性率为25.97%(60/231),GBV-C RNA检测阳性率为32.04%(74/231),抗体/核酸交叉阳性率仅2.16%(5/231)。在静脉吸毒人群中GBV-C/HIV/HCV的三重感染率明显高于GBV-C单感染和GBV-C/HCV的共感染(P<0.05);在非静脉吸毒人群中,GBV-C/HCV的共感染率明显高于GBV-C/HIV/HCV三重感染率(P<0.05);GBV-C在HIV轻症和重症的患者中的感染率明显高于在HIV中症患者的感染(P<0.05)。为验证GBV-C对HIV-1和HCV感染者病程的影响,本研究对GBV-C感染与患者的CD4细胞数、ALT、AST、HCV的基因型和亚型、HIV-1 RNA病毒载量和HCV RNA病毒载量等相关指标的相关性进行了分析,GBV-C感染与否,以上指标未发现显著变化。为阐明GBV-C阳性患者中GBV-C基因型流行特点,本研究进而对GBV-C RNA阳性样本的GBV-C 5’NCR、E2基因及病毒全基因进行扩增、序列测定与同源关系分析,发现43例GBV-C感染者中除1例(NK07)属于3型,2例(DH019和DH021)属于4型外,其它40例所感染毒株不属于已知基因型且独立成簇。Bootstrap值分别为:5’NCR,97%;E2,99%;Full-length,99%。全基因组核苷酸序列分析结果显示,新基因型序列间相似性为91.2%-99.2%,不同基因型间相似性为86.2%-89%,Simplot和Bootscanning分析表明,所有获得新基因型全基因组序列不存在型间重组现象,该毒株可被命名为GBV-C7型。基于现有数据,云南省GBV-C基因型分布为:7型占93.02%(40/43)、4型占4.65%(2/43)、3型仅占2.33%(1/43);在IDU人群中,7型为93.10%(27/29)、4型为6.90%(2/29)、没有发现3型的存在;在非IDU人群中,7型为92.86%(13/14)、3型为7.14%(1/14)、未发现4型的存在。鉴于GBV-C基因分型尚无公认方法和界定标准,本研究提出了以GBV-C E2区序列为主要分型靶序列,平均遗传距离小于0.0900视为同一基因型,介于0.1282~0.1438之间可视为不同基因型,平均遗传距离介于0.0900~0.1282之间时,该毒株可能为基因重组型或者同一种基因型,需经重组位点分析确定。为揭示GBV-C起源与进化,本研究分别根据GBV-C全长基因组序列、5NCR、E1、E2和NS5B区的核酸序列变异情况,对GBV-C进化速率和可能起源时间进行推算,所得的GBV-C分子进化速率为10-5~10-2sub/site/year,推断GBV-C的起源时间为152.96~1798.76年以前。比较而言,病毒E1/E2区(nt 900-1250)核酸序列更适合用于GBV-C的起源与进化研究,以此序列计算得到GBV-C五种基因型的分子进化速率介于10-4~10-2sub/site/year之间。根据各基因型病毒的地域分布、变异率和进化速率推断其起源时间和可能起源地,发现GBV-C 1型起源于非洲西部(1238年)、GBV-C 2型起源于欧洲(1928年)、3型起源于日本(1987年)、4型起源于东南亚(1981年)、5型起源于非洲南部(1975年)。总结我国主要GBV-C流行株的进化和传播特点为,GBV-C 3型由日本传播至中国,GBV-C 4型由东南亚分别经云南地区传播至中国内陆地区。在云南省,GBV-C 4型可能以东南亚国家接壤的德宏地区、红河地区和文山地区为源头,传播到云南省中部地区(大理和昆明地区),再经中部地区向我国内陆地区的传播。最后,为了探索GBV-C的自身高清除率的相关机制,本论文就宿主细胞microRNA对GBV-C复制的影响进行了研究。利用生物学相关软件以GBV-C 3’NCR为靶基因预测了机体内相关的rnicroRNA共计12种,从中筛选出最可能与GBV-C 3’NCR发生作用的三种microRNA,即Has-miR148a、Has-miR-152和Has-miR-301。进而,建立了此三种microRNA的茎环RT-PCR和SYBR染料的荧光定量PCR的检测方法,以及GBV-C 3’NCR和三种microRNA的真核表达体系。研究结果表明,高表达miR-148a的Huh7.5.1细胞中,GBV-C 3’NCR基因的表达量明显下降。然而,经RNAi技术抑制miR-148a表达的细胞中,GBV-C 3’NCR基因表达量明显上调。由此我们得出,Has-miR-148a与GBV-C 3’NCR之间呈负相关的生物学特性。综上所述,本论文通过对云南省不同人群和不同地区中GBV-C的感染、基因型流行、起源进化以及高清除率的相关机制的研究发现,GBV-C在云南地区高度流行且发现了新的基因型并命名为GBV-C 7型,提出了以E2区序列为基础的基因型分型的新标准;通过对GBV-C起源与进化的研究,阐明了我国和云南地区的GBV-C基因型进化特点和传播路径;证明了Has-miR-148a与GBV-C高清除率的相关性。本论文针对云南地区GBV-C的研究为首次,为今后在该地区开展相关研究提供了第一手资料,并为GBV-C和HIV共感染相关方面的研究提供了前瞻性的建议,同时为GBV-C影响HIV患者疾病进程的研究提供了参考和理论依据。
摘要第4-7页
Abstract第7-10页
插图与附表清单第18-23页
英文缩写词表第23-25页
第一章 绪论第25-49页
    1.1 庚型肝炎病毒第25-39页
        1.1.1 庚型肝炎病毒的发现和命名第25页
        1.1.2 庚型肝炎病毒的结构及其基因组特征第25-28页
        1.1.3 庚型肝炎病毒的诊断第28-30页
        1.1.4 庚型肝炎病毒的基因型的分布及分型方法第30-35页
        1.1.5 庚型肝炎病毒的起源与进化第35-39页
    1.2 庚型肝炎病毒传播和流行第39-41页
        1.2.1 庚型肝炎病毒的传播途径第39-40页
        1.2.2 庚型肝炎病毒的流行第40-41页
    1.3 庚型肝炎病毒的生物学特性第41-45页
        1.3.1 庚型肝炎病毒的致病性第41-42页
        1.3.2 庚型肝炎病毒与艾滋病病毒第42-45页
    1.4 研究云南地区病毒分子流行病学的意义第45-47页
        1.4.1 云南省特殊的地理位置第45页
        1.4.2 云南地区病毒传播对我国病毒流行的影响第45-47页
    1.5 本论文研究的目的和意义第47-48页
    1.6 本论文的创新点第48-49页
第二章 云南省GBV-C的流行及其与临床指标的相关性分析第49-66页
    2.1 引言第49-50页
    2.2 本章技术路线第50页
    2.3 实验材料和方法第50-52页
        2.3.1 实验材料第50页
        2.3.2 主要试剂第50-51页
        2.3.3 仪器设备第51页
        2.3.4 实验方法第51-52页
    2.4 实验结果第52-62页
        2.4.1 本研究样本临床指标统计第52-53页
        2.4.2 云南地区不同人群中GBV-C RT-PCR检测结果第53-54页
        2.4.3 云南省GBV-C的流行第54页
        2.4.4 云南省静脉吸毒人群中不同病原体的感染率分析第54-55页
        2.4.5 云南省非静脉吸毒人群中不同病原体的感染率分析第55-56页
        2.4.6 云南省不同地州和不同人群的GBV-C感染情况第56-57页
        2.4.7 云南省静脉吸毒人群HIV患者不同病程中GBV-C的流行第57-58页
        2.4.8 云南省静脉吸毒人群中GBV-C对HIV/HCV共感染患者影响第58-59页
        2.4.9 云南省静脉吸毒人群中GBV-C对HCV患者的影响第59-60页
        2.4.10 云南省非静脉吸毒人群中GBV-C对HCV患者的影响第60页
        2.4.11 云南省不同人群中GBV-C与HCV基因型和亚型的相关性分析第60-62页
    2.5 讨论第62-65页
        2.5.1 云南省不同地区不同人群中GBV-C的感染率第62页
        2.5.2 本研究中GBV-C诊断指标的选择第62-63页
        2.5.3 本研究中GBV-C感染的偏好性第63-64页
        2.5.4 本研究中GBV-C的感染与HIV患者临床指标的相关性第64页
        2.5.5 GBV-C影响HIV患者临床指标的研究第64-65页
    2.6 小结第65-66页
第三章 云南地区GBV-C基因型分布与新基因型的发现第66-90页
    3.1 引言第66-67页
    3.2 本章技术路线第67-68页
    3.3 实验材料和方法第68-72页
        3.3.1 实验材料第68页
        3.3.2 主要试剂第68页
        3.3.3 仪器设备第68页
        3.3.4 实验方法第68-72页
    3.4 实验结果第72-83页
        3.4.1 GBV-C 5'NCR和E2区RT-PCR的扩增第72-73页
        3.4.2 GBV-C 5'NCR和E2区扩增片段测序结果第73-74页
        3.4.3 GBV-C 5'NCR和E2区序列基因分型的能力分析第74-75页
        3.4.4 基于GBV-C 5'NCR区序列对GBV-C的基因分型第75-76页
        3.4.5 基于GBV-C E2区序列对GBV-C的基因分型第76-77页
        3.4.6 GBV-C全基因组序列的扩增第77-78页
        3.4.7 GBV-C全基因组序列片段测序和序列拼接第78页
        3.4.8 GBV-C 7型与其它基因型间核苷酸序列相似性比较第78-79页
        3.4.9 基于GBV-C全长基因序列对GBV-C的基因型的分析第79-80页
        3.4.10 GBV-C 7型重组位点的分析第80-81页
        3.4.11 云南省GBV-C基因型的流行特点第81-82页
        3.4.12 GBV-C E2区与HIV相互作用的氨基酸位点的分析第82-83页
    3.5 讨论第83-88页
        3.5.1 GBV-C基因型的命名第83页
        3.5.2 GBV-C基因分型的标准第83-86页
        3.5.3 我国GBV-C基因型流行特点第86-87页
        3.5.4 云南省GBV-C基因型流行及其分析第87-88页
        3.5.5 GBV-C与HIV间的相互作用第88页
    3.6 小结第88-90页
第四章 庚型肝炎病毒的起源与进化第90-119页
    4.1 引言第90-91页
    4.2 技术路线图第91-92页
    4.3 材料与方法第92-94页
        4.3.1 实验材料第92页
        4.3.2 主要软件第92页
        4.3.3 实验方法第92-94页
    4.4 实验结果第94-111页
        4.4.1 GBV-C的进化速率第94-95页
        4.4.2 GBV-C的起源第95-96页
        4.4.3 GBV-C的基因组序列的变异特征第96-97页
        4.4.4 基于高变区序列进行GBV-C的基因分型第97-98页
        4.4.5 基于E1/E2高变区序列进行GBV-C的基因分型第98-99页
        4.4.6 不同基因型GBV-C的分子进化速率第99-100页
        4.4.7 GBV-C五种基因型流行及其进化特征第100-109页
        4.4.8 南省GBV-C主要基因型的流行及其进化特征第109-111页
    4.5 讨论第111-118页
        4.5.1 GBV-C的分子进化速率第111-114页
        4.5.2 GBV-C进化速率的选择第114页
        4.5.3 GBV-C各基因型起源进化的比较第114-115页
        4.5.4 中国GBV-C主要流行株的传播第115-117页
        4.5.5 研究病毒起源及其进化动力学的意义第117-118页
    4.6 小结第118-119页
第五章 庚型肝炎病毒自身高清除率与机体microRNA的相关性第119-143页
    5.1 引言第119-120页
    5.2 技术路线第120-121页
    5.3 实验材料与方法第121-125页
        5.3.1 实验材料第121-122页
        5.3.2 主要试剂第122-123页
        5.3.3 仪器设备第123页
        5.3.4 实验方法第123-125页
    5.4 实验结果第125-134页
        5.4.1 与GBV-C 3'NCR区序列相关的microRNA预测第125-127页
        5.4.2 GBV-C 3'NCR区序列相关microRNA的筛选第127页
        5.4.3 GBV-C3'NCR和microRNA基因定性PCR检测第127-128页
        5.4.4 GBV-C 3'NCR和microRNA基因的测序结果第128-129页
        5.4.5 GBV-C 3'NCR和microRNA基因荧光定量PCR检测方法的建立第129-130页
        5.4.6 GBV-C 3'NCR与microRNA基因真核表达体系的建立第130-132页
        5.4.7 microRNA与GBV-C 3'NCR间的相互作用第132页
        5.4.8 Has-mir-148a与GBV-C 3'NCR间的相互作用第132-134页
    5.5 讨论第134-141页
        5.5.1 MicroRNA的检测方法的选择第134-136页
        5.5.2 本研究检测体系中参照基因的选择第136-137页
        5.5.3 Has-miR-148a与GBV-C 3'NCR间的相互作用第137-138页
        5.5.4 Has-miR-148a与GBV-C 3'NCR作用位点的分析第138-139页
        5.5.5 Has-miR-148a的其它生物学功能第139-140页
        5.5.6 GBV-C的高清除率与Has-miR-148a的相关性第140-141页
    5.6 小结第141-143页
第六章 结论与展望第143-147页
致谢第147-148页
参考文献第148-161页
附录A 攻读硕士期间发表论文目录第161页
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