第一部分人TIM-1和TIM-3 mRNA实时SYBR Green I定量RT-PCR检测方法的建立目的：建立实时SYBR Green I定量RT-PCR检测人TIM-1和TIM-3 mRNA的方法。方法：从人外周血单个核细胞提取的总RNA中逆转录扩增人TIM-1和TIM-3的cDNA,将将纯化的人TIM-1和TIM-3的扩增产物分别与pMD18-T Simple载体进行连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA, PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260 nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验。结果：建立了TIM-1和TIM-3基因基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为103-107拷贝。阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性相关系数分别为1.00和1.00,扩增效率分别为1.070和1.023,批内及批间变异系数<5%。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰。结论：我们成功建立检测人TIM-1和TIM-3的实时荧光定量PCR方法,为进一步研究人TIM-1和TIM-3功能奠定基础。第二部分人T细胞免疫球蛋白粘蛋白基因家族及其融合蛋白真表达载体的构建和生物信息学分析目的：分别构建人T细胞免疫球蛋白粘蛋白基因3成员及其融合蛋白真核表达载体,并对TIM基因家族3个成员进行生物信息学分析。方法：采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,利用两步法RT-PCR技术扩增TIM基因家族3个成员及其胞外(结构)域基因片段和人IgG1 Fc基因片段。并将它们分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1 (+)中,通过PCR及测序进行鉴定。序列分析后将TIM-3胞外(结构)域基因片段亚克隆到已经克隆了人IgGl Fc基因片段真核表达载体pcDAN3.1(+)上；并通过PCR及双酶切进行鉴定。并应用生物信息学初步分析TIM基因家族的物理化学性质、蛋白质结构域、功能。结果：成功从PBMC中提取并逆转录的cDNA扩增出TIM基因家族3个成员及其胞外(结构)域基因和人IgG1 Fc基因；经PCR、酶切鉴定、测序分析表明它们与GenBank提供的序列信息完全相同。生物信息学分析结果表明TIM-1蛋白为不稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,相对分子量是39.2KD,等电点pI为6.44。该蛋白含约23.08%的α-螺旋,29.67%的延伸链,47.25%的不规则卷曲,1段20个氨基酸组成的信号肽。TIM-1蛋白亚细胞定位于内质网、高尔基体、细胞膜上。功能分析预测TIM-1蛋白具有受体、信号转导、免疫应答功能。TIM-3蛋白为稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,相对分子量是33.4KD,等电点pI为5.54。该蛋白含约32.56%的α-螺旋,8.27%的延伸链,49.17%的不规则卷曲,1段21个氨基酸组成的信号肽。TIM-3蛋白亚细胞定位于内质网、高尔基体、液泡、细胞膜上。功能分析预测TIM-3蛋白具有受体和信号转导功能。TIM-4蛋白为不稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,相对分子量是41.6KD,等电点pI为5.75。该蛋白含约10.32%的α-螺旋,29.89%的延伸链,59.79%的不规则卷曲,1段24个氨基酸组成的信号肽。TIM-4蛋白亚细胞定位于细胞质、细胞核、分泌系统的小囊泡、线粒体、内质网、高尔基体上。功能分析预测TIM-4蛋白具有受体和信号转导功能。结论：成功构建TIM基因家族成员及其融合蛋白真核表达载体,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解TIM基因家族成员的性质特征,为进一步研究该基因家族奠定基础。第三部分人T细胞免疫球蛋白黏蛋白与凋亡细胞的相互作用研究目的：为了研究人T细胞免疫球蛋白粘蛋白基因家族与凋亡细胞之间的相互作用,以进一步探讨TIM基因家族在细胞凋亡中作用。方法：我们构建含人TIM基因三个成员不同长度片段的9种pEGFP-N1真核表达载体及其Ig融合蛋白表达载体。将这些构建的真核表达载体瞬时转染CHO细胞,并收集上清液。直接采用TIM-EGFP融合蛋白与PI为探针,检测TIM蛋白与凋亡细胞的相互作用。结果：人TIM基因家族的3个蛋白都能直接识别和结合凋亡细胞,而与活细胞不能结合。并且,sTIM-1-EGFP、sTIM-3-EGFP和sTIM-4-EGFP融合蛋白与凋亡细胞之间的相互作用被相应的TIM-1-Ig、TIM-3-Ig和TIM-4-Ig所阻止。而且,结果表明人TIM基因家族的3个蛋白通过其IgV区直接识别和结合凋亡细胞。结论：人TIM基因家族的3个蛋白充当凋亡细胞的受体,可能在细胞凋亡调控中起重要作用。人TIM蛋白可以作为新的蛋白用于细胞凋亡的检测。第四部分人TIM-EGFP融合蛋白的在大肠杆菌中的表达和特征的研究目的：为了探讨人TIM-EGFP融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化,并评价它们的生物活性。方法：采用PCR分别扩增人TIM基因家族3成员和EGFP片段,并且将它们克隆至原核表达载体pET-28a中。构建的重组质粒pET-28a-TIM-EGFP分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达TIM-EGFP融合蛋白。表达的融合蛋白经Ni-NTA树脂纯化,并且通过荧光显微镜检测它们与凋亡细胞的结合活性。结果：我们分别成功构建人TIM-1-EGFP、TIM-3-EGFP和TIM-4-EGFP的融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达。我们结果证明TIM-EGFP融合蛋白3个成员都能直接识别和结合凋亡细胞,而与活细胞不能。我们更进一步证实TIM-4-EGFP与凋亡细胞的相互作用可以被相应的TIM-Ig融合蛋白阻止。结论：我们分别成功构建人TIM-1-EGFP、TIM-3-EGFP和TIM-4-EGFP的融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达。据我们所知,这是目前首次在大肠杆菌中表达TIM基因家族的3个成员。我们结果也表明人TIM基因家族介导与凋亡细胞的识别和结合。而且,纯化的融合蛋白可以作为准备好的生物活性的TIM-1、TIM-3和TIM-4来源,这为进一步研究人TIM-1、TIM-3和TIM-4基因和它们的相应受体功能和调节机制奠定基础。
