贯叶连翘中黄酮类化合物的提取、分离及结构鉴定

贯叶连翘在我国分布广泛，资源丰富，人工栽培面积不断扩大，自2005年被中国药典收录以后，学术界对其的研究也相对增多，传统中医研究表明，贯叶连翘有清热解毒、调经活血的功效，现代药理学研究表明，它具有抗抑郁、抗病毒等作用，其中的黄酮类化合物具有抗衰老、抗糖尿病及抗氧化等多种生物活性。本实验以贯叶连翘为原材料，探索了其中黄酮类化合物的提取和初步分离工艺，并分离出黄酮类化合物的单体，最后对单体进行了结构鉴定。本实验课题为进一步高效合理地开发利用贯叶连翘药材提供了科学的理论依据，增大了药材的利用价值。本试验建立了贯叶连翘中黄酮类化合物含量测定的紫外-可见分光光度法，样品的80%乙醇溶液在紫外光区的最大吸收波长为360nm，添加显色剂后在可见光区的最大吸收波长为510nm，在0.015-0.075mg/mL浓度范围内，A510与芦丁含量间有良好的线性关系。贯叶连翘黄酮类化合物的提取采用超声波辅助有机试剂提取法，以芦丁的含量为指标，考察提取试剂的种类、浓度、超声处理的时间、温度、频率、次数，以及料液比等因素对黄酮类化合物得率的影响，从中选择影响较大的四个因素设计正交试验，得到最佳的提取工艺：称取一定量的贯叶连翘干燥药材粉末，按照料液比1:30，以体积分数为60%的乙醇作为提取溶剂，提取两次，每次45min，所得黄酮类化合物的含量最大，为7.003%。对贯叶连翘黄酮类化合物的乙醇粗提液进行初步分离纯化，选择三种较宜分离黄酮类化合物的大孔吸附树脂，即D101、D4020、AB-8。通过静态吸附实验和静态解吸实验，比较三种大孔吸附树脂的静态吸附量和解吸率，结果显示，D101型大孔吸附树脂的静态吸附量最大，为78.767mg/g，以40%的乙醇解吸时解吸率最大，为90.2%，因此三种树脂中，D101大孔吸附树脂对贯叶连翘中黄酮类化合物的分离效果最好，并通过动态吸附及洗脱实验考察样品液浓度、上样量、洗脱剂体积分数以及洗脱剂用量等条件对分离效果的影响，从而确定了初步分离最佳的洗脱工艺，结果表明：选用D101大孔吸附树脂，样品液浓度为3.202mg/mL，上样量约为8倍的树脂体积，最佳洗脱剂为体积分数40%的乙醇，用量为3BV。同时采用有机溶剂萃取法对贯叶连翘黄酮类化合物的粗提液初步分离，依次采用石油醚（沸程60℃-90℃）、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取。将分别经过大孔吸附树脂和有机溶剂萃取初步分离的样品，经硅胶柱层析法进行进一步的分离纯化，以石油醚-乙酸乙酯和乙酸乙酯-甲醇作为洗脱剂，梯度洗脱，收集的洗脱液浓缩后，采用薄层层析法进行定性鉴定，其中薄层层析的展开剂系统为三氯甲烷:甲醇:甲酸(17:2:1)。初步分离后的样品大约经两至三次硅胶柱层析后，分别得到三种黄酮类化合物的单体，经核磁共振波谱法结构鉴定，参考相应的文献，确定三种化合物分别为：槲皮素、异槲皮苷、芸香苷。