新发现甲状腺激素受体β亚型的研究

甲状腺激素受体论文 可变剪接论文 定点突变论文 融合表达论文 放射性配体结合论文 实验论文 电泳迁移
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甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors, TRs)属于核受体超家族的成员,由TRa和TRB基因编码。TRa和TRB基因由于选择性剪接或转录起始位置的不同而产生若干同工体(isoform)。主要有TRa1、TRa2、TRa3、TRβ1、TRβ2 TRβ3和截短的TRΔα1、TRΔα2、TRΔβ3等。先前本室在大鼠肝脏发现一个新的TRB的新同工体,它不是又一个截短的TRB亚型(例TRΔβ3),而是一个加长的、带有一个超长的DNA结合域的新亚型,被命名为TRp△(不是TRAp);同时发现了一个新的外显子(exon N)。本文对其进行了继续研究即其来源、生成过程及其若干组织内分布;同时我们又幸运的发现了又一新的同功体TRB2Δ。本文将分成三部分叙述:一、TRp△通过可变剪接生成的蛋白水平论据;二、又一个新发现的TRB同工体(TRβ2Δ)的研究。三、初步探索核受体超家族中其他成员的DBD区是否也存在类似的未被发现的新外显子。为了深入了解TRβ△剪接方式在蛋白水平的论据,我们截取了TRβ基因外显子3的3’端部分、内含子3-4全长、以及外显子4的5’端的部分序列共约6.4kb的基因组DNA片段命名为TRβ小基因。以含有上述小基因的质粒为模板体外转录pre-mRNA,再利用体外剪接系统(不同的细胞系),进行剪接实验;为了便于检测剪切的蛋白产物,在小基因后分别融合了增强型绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因,利用定点碱基删除改造小基因后进行体外转染实验同时给予T3处理,观测剪接、翻译的变化。RT-PCR显示:TRβ小基因在多种细胞系中被成功转录并剪接成两种转录本;蛋白水平检测:(1)绿色荧光蛋白检视阳性细胞率和荧光素酶活性值在剪接形成外显子3/N/4时均明显高于剪接形成外显子3/4时;(2)T3处理后,剪接形成外显子3/N/4时产生荧光素酶活性值明显高于无T3处理组。因此说明TRB小基因在mRRNA及蛋白水平均以剪接成为外显子3/N/4为主,并且该剪接产物受到其配体的正性调节。为了进一步了解TRp△在不同组织的表达图式,采用Real-time荧光定量PCR分析TRβΔ、TRβ1及TRβΔ+TRβ1转录本在成年大鼠肝、脑、心肌、肺、肾、脾、骨骼肌及睾丸组织中的含量。结果显示:除睾丸组织外均可检测到TRp△与TRβ1的表达,其中心肌表达量最高,脑组织低表达,并且各组中TRp△的表达量均显著高于TRβ1,并在TRβ1+TRβΔ的和值(sum)中占绝大的比例。利用PCR方法初步探索到垂体中存在TRβ2的新亚型,全长扩增测序,序列提交Genbank,被命名为TRbeta2Delta (TRβ2Δ, HM043807.1)。Real-time荧光定量PCR分析TRβ2Δ, TRβ2及TRβ2Δ+TRβ2mRNA在成年大鼠垂体组织中的分布特点,结果显示TRβ2及TRβ2Δ在垂体组织中的表达水平大致相等而无明显差别。将新发现的TRβ2ΔcDNA编码序列克隆入融合型原核表达载体pQE-30Xa并进行表达。SDS-PAGE表征表达产物的分子量和相对表达水平,Western-blotting鉴定。TRB2Δ融合蛋白的表达量达到20.21mg/L培养基。目的蛋白占菌体总蛋白的26.3%。重组蛋白含有6×His标签,经Ni-NTA树脂亲和层析纯化的重组蛋白用于放射性配体结合试验(RLBA)和电泳迁移率改变试验(EMSA),结果证实重组TRB2Δ可与T3特异性结合,Ka为2.3±0.11xl0-9L/mol;可单独或与RXR一起结合DNA。为了进一步证明TRβ2Δ不仅能够与其配体及特异性DNA结合,而且结合后可调节靶基因的转录活性,我们构建了pcDNA3.1/TRβ2Δ真核表达载体及含有PAL TRE的pGL3-Promoter报告基因载体,共转染COS-7细胞。结果显示,T3处理组荧光素酶活性明显高于无T3处理组;单独转染含PAL TRE的pGL3-Promoter报告基因载体,由于缺乏与TRE序列结合的TRB2Δ,因此无论T3存在与否与共转染组相比荧光素酶活性值皆低而无变化。说明TRβ2Δ与其配体结合后与TRE结合促进靶基因的转录,进一步证明TRβ2A是一个功能性的TRβ新亚型。为了探索核受体超家族中其他成员的DBD区是否也存在类似的未被发现的新外显子,本文选择了糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)、雌激素受体(estrone receptor, ER)、雄激素受体(androgen receptor, AR)、维生素D3受体(vitamin D3 receptor, VDR)四个核受体超家族中的成员,通过Genbank分别确定各自的DBD结合区,设计特异性引物去扩增、检测该区是否存在未被发现的新外显子,结果未能在DBD结合区发现类似TR受体中新外显子的存在。因而未能找到加长的同工体。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-7页
缩略语第11-13页
前言第13-18页
    研究现状、成果第13-17页
    研究目的、方法第17-18页
一、甲状腺激素受体B新亚型TRβ△可变剪接的蛋白水平研究第18-66页
    1.1 对象和方法第18-37页
        1.1.1 实验材料第18-20页
        1.1.2 带有报告基因的小基因构建、改造及体外转染第20-35页
        1.1.3 实时荧光定量PCR检测不同组织中TRβ△和TRβ1 mRNA的表达水平第35-37页
    1.2 结果第37-55页
        1.2.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定第37页
        1.2.2 重组质粒的酶切及突变鉴定结果第37-40页
        1.2.3 RT-PCR测定剪接结果第40-44页
        1.2.4 绿色荧光蛋白检视第44-47页
        1.2.5 荧光素酶的活性值分析结果第47-49页
        1.2.6 T3处理后不同细胞系荧光素酶活性分析结果第49-51页
        1.2.7 不同剂量T3处理后大鼠肝细胞系BRL荧光素酶的活性值分析结果第51-52页
        1.2.8 实时荧光定量PCR检测TRβ△和TRβ1 mRNA不同组织中的表达水平第52-55页
    1.3 讨论第55-65页
        1.3.1 前体mRNA可变剪接分析第55-57页
        1.3.2 构建重组质粒第57页
        1.3.3 突变重组质粒第57-59页
        1.3.4 体外转染实验第59-60页
        1.3.5 荧光实时定量PCR第60-64页
        1.3.6 TRβ△表达的空间差异第64-65页
    1.4 小结第65-66页
二、一个新的在垂体中特异表达的TRβ同工体的发现第66-94页
    2.1 对象(材料)和方法第66-76页
        2.1.4 大鼠TRβ2ΔcDNA克隆、表达及产物的纯化第67-71页
        2.1.5 重组TRβ2△活性鉴定第71-76页
    2.2 结果第76-87页
        2.2.1 大鼠垂体组织总RNA的提取第76页
        2.2.2 RT-PCR检测大鼠垂体组织中是否存在加长型TRβ2同工体第76-78页
        2.2.3 实时荧光定量PCR检测大鼠垂体组织中的TRβ2△和TRβ2表达水平第78-81页
        2.2.4 大鼠TRβ2ΔcDNA克隆表达及产物的纯化第81-84页
        2.2.5 重组TRβ2△活性鉴定第84-87页
    2.3 讨论第87-93页
        2.3.1 关于大鼠垂体组织中TRβ2加长型同工体的发现第87-88页
        2.3.2 大鼠垂体组织中TRβ2△基因表达水平第88-89页
        2.3.3 大鼠TRβ2ΔcDNA克隆、表达及产物的纯化第89-90页
        2.3.4 重组TRβ2△活性鉴定第90-93页
    2.4 小结第93-94页
三、核受体家族其他成员DBD区的初步研究第94-101页
    3.1 对象和方法第94-95页
        3.1.1 实验材料第94页
        3.1.2 初步检测大鼠组织中VDR、AR、ER、GR中有无带着加长型DBD的同工体第94-95页
    3.2 结果第95-97页
        3.2.1 大鼠肝、肾、脑、垂体、骨骼肌、肺等组织总RNA的提取第95-96页
        3.2.2 RT-PCR检测VDR、GR、AR、ER在大鼠不同组织中DBD的大小第96-97页
    3.3 讨论第97-100页
    3.4 小结第100-101页
结论第101-102页
论文创新点第102-103页
参考文献第103-110页
发表论文和参加科研情况说明第110-112页
附录第112-123页
综述 真核生物pre-mRNA选择性剪接的研究进展第123-144页
    综述参考文献第138-144页
致谢第144页
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