枸杞叶多糖的分离纯化、结构表征及降血糖活性分析

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近些年来,糖尿病的发病率和死亡率逐渐增高,严重威胁人类健康。目前主要采用注射胰岛素或口服药物治疗法,如磺脲类,双胍类药物等。然而,持续地使用通过化学原料及方式合成的治疗糖尿病的药物会对人体产生较大的副作用,且大量研究表明,从天然产物中筛选出降血糖因子,研制辅助降血糖的功能性食品,是缓解糖尿病的途径之一。且有研究表明抗氧化与降血糖的存在密切的关系,抗氧化能力的降低代表着体内清除自由基能力的降低,进而会促使血糖的升高。因而本文采用响应面法(RSM)优化超声-微波联合萃取(UMCE)枸杞叶多糖(Lycium barbarum leaves polysaccharides,LLP)的提取工艺,经过 Molish 试验、Fehling试验、I-KI试验等鉴定所提物为多糖类物质,并用梯度浓度乙醇分级法将纯化好的LLP分级,用扫描电子显微镜(SEM)、傅立叶红外色谱法(FTIR)、及圆二色谱法(CD)对LLP的结构表征进行分析,并采用柱前衍生化(PMP)-HPLC法测定了 LLP的单糖组分。此外还对LLP进行了抗氧化活性和降血糖活性方面的研究,为枸杞叶的科学开发与综合利用提供了依据。首先,本文对超声-微波联合萃取(UMCE)对LLP的工艺条件进行了优化并初步探究了其提取机理。与传统水浴加热法(HWE)、微波辅助提取法(MAE)、超声辅助提取法相比(UAE),UMCE法显著的提高了 LLP的提取率,通过Molish实验、I-KI实验以及Fehling试剂验证所提物质为多糖类物质,采用反复水提醇沉及Sevage脱蛋白法对多糖进行纯化,接着对纯化后的LLP进行梯度乙醇分级,分别用30%,50%,70%无水乙醇将其分为LLPs(LLP30,LLP50,LLP70)。通过对LLP的结构表征进行分析外,联合PMP-HPLC测定了不同组分多糖的单糖构成及含量。发现经过梯度乙醇醇沉得到的LLPs的单糖构成和含量各不相同,LLP30中含有的单糖组分为甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(Gal UA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)以及阿拉伯糖(Ara),其中Gal UA的含量最高。四种多糖组分中Gal UA和Ara占主要单糖成分,且LLP30中各单糖的含量普遍较高,但其Gal含量低于LLP50。LLP70,LLPt的单糖含量则普遍较低。其次,测定了枸杞叶多糖的不同组分的体外抗氧化活性。采取ABTS +(2,2’-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐)、DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、超氧阴离子(O2-)及羟自由基(·OH)的方式分析了 LLPs的体外抗氧化活性,并采用α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶研究了 LLPs的不同组分的体外降血糖活性。结果表明LLPs对ABTS·+、DPPH·、O2-和·OH均具有较强的清除能力,其中LLP50和LLP30的体外抗氧化能力较强。同时LLPs对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具有抑制能力,其中,LLP50然而对α-葡萄糖苷酶的抑制能力较强。因而选用这一组分的枸杞叶多糖饲喂链脲佐菌素(STZ)导致的Ⅰ型糖尿病小鼠,经测定其每日饮水量、摄食量、体重值以及血糖值,发现高浓度的LLP50可以显著降低糖尿病小鼠的血糖值。取小鼠的血清、肝脏及肾脏研究其体内超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活力,以及血清内糖化血清蛋白(GSP)和血清胰岛素的含量的测定。结果发现800mg/kg/d的LLP50可显著提高小鼠血清胰岛素的含量,降低血清GSP的含量,并在温和地降低血糖的同时也能较好的保护糖尿病小鼠脏器及血清内酶的活力。最后,研制出一款枸杞叶多糖辅助降血糖含片,符合国家的食品安全标准。
摘要第3-5页
Abstract第5-6页
第1章 文献综述第12-18页
    1.1 糖尿病概述第12页
    1.2 天然植物多糖降血糖研究进展第12-13页
    1.3 降血糖与抗氧化的关系第13页
    1.4 枸杞叶多糖的研究进展第13-16页
        1.4.1 多糖的提取方法第14-15页
        1.4.2 多糖的结构分析第15-16页
        1.4.3 多糖的应用第16页
    1.5 辅助降血糖保健品的市场开发现状第16页
    1.6 选题的目的和意义第16-18页
第2章 枸杞叶多糖的提取与分离第18-34页
    2.1 引言第18页
    2.2 试材与设备第18-19页
        2.2.1 材料第18页
        2.2.2 试剂第18页
        2.2.3 仪器第18-19页
    2.3 试验方法第19-22页
        2.3.1 枸杞叶样品制备第19页
        2.3.2 枸杞叶多糖的提取第19页
            2.3.2.1 超声-微波联合提取方法第19页
            2.3.2.2 其他提取方法第19页
        2.3.3 多糖提取率的测定第19-20页
        2.3.4 超声-微波联合提取条件优化第20页
            2.3.4.1 单因素实验第20页
            2.3.4.2 响应面设计第20页
        2.3.5 多糖的分级第20-21页
        2.3.6 多糖的定性第21页
            2.3.6.1 Molish实验第21页
            2.3.6.2 Fehling实验第21页
            2.3.6.3 I-KI实验第21页
            2.3.6.4 紫外全波长扫描第21页
        2.3.7 统计分析第21-22页
    2.4 结果与讨论第22-33页
        2.4.1 单因素实验第22-24页
            2.4.1.1 微波时间对LLP提取率的影响第22页
            2.4.1.2 超声时间对LLP提取率的影响第22-23页
            2.4.1.3 粒度对LLP提取率的影响第23-24页
            2.4.1.4 液固比对LLP提取率的影响第24页
        2.4.2 响应面试验第24-31页
            2.4.2.1 模型与数据分析第24-27页
            2.4.2.2 响应面图与等高线图分析第27-31页
            2.4.2.3 对最佳提取工艺的验证第31页
        2.4.3 与其他提取方法的比较结果第31-32页
        2.4.4 多糖的定性实验结果第32-33页
    2.5 小结第33-34页
第3章 枸杞叶多糖的理化性质、结构表征及抗氧化活性分析第34-54页
    3.1 引言第34页
    3.2 试材与设备第34-35页
        3.2.1 材料第34页
        3.2.2 试剂第34-35页
        3.2.3 仪器第35页
    3.3 试验方法第35-39页
        3.3.1 多糖的结构鉴定第35-36页
            3.3.1.1 枸杞叶多糖的电镜观察第35页
            3.3.1.2 枸杞叶多糖的红外光谱扫描第35页
            3.3.1.3 枸杞叶多糖的圆二色谱扫描第35-36页
        3.3.2 枸杞叶多糖的单糖组成测定第36-37页
            3.3.2.1 枸杞叶多糖的水解第36页
            3.3.2.2 单糖标品的配制第36页
            3.3.2.3 样品和单糖标品的柱前衍生化第36页
            3.3.2.4 色谱条件第36页
            3.3.2.5 各单糖标准曲线绘制第36-37页
            3.3.2.6 枸杞叶多糖中各单糖的含量计算第37页
        3.3.3 粘均分子量的测定第37页
        3.3.4 枸杞叶多糖的溶解性的测定第37页
        3.3.5 体外抗氧化试验第37-39页
            3.3.5.1 对ABTS~(·+)的清除能力第37-38页
            3.3.5.2 对DPPH·的清除能力第38页
            3.3.5.3 对·OH自由基清除能力第38页
            3.3.5.4 对O_2~-的清除能力第38-39页
        3.3.6 统计学方法第39页
    3.4 结果与讨论第39-52页
        3.4.1 多糖的结构鉴定结果第39-41页
            3.4.1.1 多糖的电镜扫描图第39-40页
            3.4.1.2 多糖的红外光谱分析结果第40页
            3.4.1.3 多糖的圆二色谱分析结果第40-41页
        3.4.2 枸杞叶多糖的单糖组成测定结果第41-46页
            3.4.2.1 各单糖的标准曲线及线性关系第41-43页
            3.4.2.2 枸杞叶多糖的液相色谱图第43-46页
        3.4.3 枸杞叶多糖的不同组分的粘均分子量第46页
        3.4.4 枸杞叶多糖的溶解性的测定结果第46-48页
        3.4.5 枸杞叶多糖体外抗氧化活性第48-52页
            3.4.5.1 对ABTS~(·+)的清除能力第48页
            3.4.5.2 对DPPH·的清除能力第48-49页
            3.4.5.3 对·OH自由基的清除能力第49页
            3.4.5.4 对O_2~-的清除能力第49-52页
    3.5 小结第52-54页
第4章 枸杞叶多糖的降血糖活性分析第54-72页
    4.1 引言第54页
    4.2 试材与设备第54-55页
        4.2.1 实验动物第54页
        4.2.2 试剂第54-55页
        4.2.3 仪器第55页
    4.3 试验方法第55-59页
        4.3.1 体外降血糖试验第55-56页
            4.3.1.1 LLPs对α-葡萄糖苷酶的抑制活力的测定第55页
            4.3.1.2 LLPs对α-淀粉酶的抑制活力的测定第55-56页
        4.3.2 体内降血糖试验第56-58页
            4.3.2.1 溶液的配制第56页
            4.3.2.2 糖尿病小鼠的模型构建第56页
            4.3.2.3 实验小鼠的分组及给药方法第56-57页
            4.3.2.4 对实验小鼠生活指标的测定第57页
            4.3.2.5 小鼠空腹血糖值的测定第57页
            4.3.2.6 处死与解剖第57页
            4.3.2.7 小鼠脏器重和脏体比的测定第57页
            4.3.2.8 小鼠糖化血清蛋白(GSP)含量的测定第57-58页
            4.3.2.9 小鼠血清胰岛素含量的测定第58页
            4.3.2.10 小鼠抗氧化性能的试验第58页
        4.3.3 统计分析方法第58-59页
    4.4 结果与讨论第59-70页
        4.4.1 枸杞叶多糖体外降血糖活性第59-62页
            4.4.1.1 不同组分多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制效果第59-60页
            4.4.1.2 不同组分多糖对α-淀粉酶的抑制效果第60-62页
        4.4.2 LLP_(50)对糖尿病小鼠生活指标的影响第62-65页
            4.4.2.1 LLP_(50)对糖尿病小鼠体重的影响第62-63页
            4.4.2.2 LLP_(50)对糖尿病小鼠饮水量的影响第63-64页
            4.4.2.3 LLP_(50)对糖尿病小鼠摄食量的影响第64-65页
        4.4.3 LLP_(50)对糖尿病小鼠血糖值的影响第65-66页
        4.4.4 LLP_(50)对糖尿病小鼠脏器重及脏体比的影响第66-67页
        4.4.5 LLP_(50)对糖尿病小鼠血清胰岛素和GSP含量的影响第67页
        4.4.6 LLP_(50)对糖尿病小鼠体内CAT和T-SOD活力的影响第67-70页
    4.5 小结第70-72页
第5章 枸杞叶辅助降血糖含片的研制第72-84页
    5.1 引言第72页
    5.2 材料与设备第72-73页
        5.2.1 材料第72页
        5.2.2 仪器第72-73页
    5.3 试验方法第73-76页
        5.3.1 含片的基本工艺流程第73-74页
            5.3.1.1 具体操作步骤第74页
        5.3.2 含片配方和工艺优化试验第74-76页
            5.3.2.1 单因素试验第74-76页
            5.3.2.2 正交试验第76页
            5.3.2.3 含片品质测定第76页
        5.3.3 统计分析方法第76页
    5.4 结果与讨论第76-82页
        5.4.1 单因素试验第76-79页
            5.4.1.1 枸杞叶多糖的添加量对含片品质的影响第76-77页
            5.4.1.2 木糖醇的添加量对含片品质的影响第77-78页
            5.4.1.3 柠檬酸的添加量对含片品质的影响第78页
            5.4.1.4 黄原胶的添加量对含片品质的影响第78-79页
        5.4.2 正交试验第79-81页
        5.4.3 品质测定第81页
        5.4.4 本发明的优点第81-82页
    5.5 小结第82-84页
第6章 结论与展望第84-86页
    6.1 结论第84页
    6.2 展望第84-86页
参考文献第86-94页
附录第94-96页
致谢第96-98页
攻读学位期间研究成果第98页
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