成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors,FGF）是肝素结合生长因子家族中的一员,在这些FGF家族当中被研究最多的要数有140个和146个氨基酸序列组成的酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factors,aFGF）及碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factors,bFGF）,分子量约为16000Da,两者具有55%的同源性。aFGF具有促进成纤维细胞生长,神经元及重要脏器的应急损伤保护和中枢摄食调节功能,但是关于其有效生物活性部位的不明点还很多。本研究在大鼠第三脑室投予七种aFGF片段,发现了其有效的生物活性片段,为开发该物质的临床应用奠定基础。目的:1、在大鼠的第三脑室投予七种aFGF片段,通过测定其摄食量的变化来检测aFGF分子中具有调节摄食行为的活性部位。2、进一步经皮下注射有活性的片段,观察对大鼠夜间摄食的影响,以此确定该活性片段外周给药的有效性。方法:1、动物饲养及分组雄性Wistar大鼠（250-300g）162只,在明暗各12小时（07:00-19:00）周期,22±2℃的室温环境,在一个笼中饲育一只大鼠。将大鼠随机分为对照组和aFGF片段组。在脑室内注射时,将全部aFGF片段设200ng/rat、400ng/rat两个剂量组,皮下注射时,设80μg/kg、100μg/kg、300μg/kg三个剂量组,分别n = 6。2、第三脑室置管在戊巴比妥钠麻醉下（40mg/kg,腹腔内注射）,将大鼠固定在脑立体定位仪上,根据大鼠脑图,从十字缝后方0.2mm,深7.5-8.0mm,在正中位颅盖骨上打开直径约2mm的洞,以不锈钢导管插入（长18.0mm,外径0.64mm,内径0.39mm）留置;用带帽的不锈钢制导丝（长17mm,直径0.33mm）,插入已经置入的不锈钢导管内用以封闭导管。3、药物投予方法及摄食量测定①aFGF-（1-15）②[D-Trp6]-aFGF-（1-15）③[desaminoPhe1.D-Trp6]-aFGF-（1-15）④[desaminoPhe1.Lys（ε-myristyl）16]-aFGF-（1-16）⑤[Lys（ε-myristyl）16]-aFGF-（1-16）⑥[D-Trp6.Lys（ε-myristyl）16]-aFGF-（1-16）⑦[Ala16] aFGF-（1-29）,将设计好的七种aFGF分子片段在无麻醉下于18:30-19:00从第三脑室留置的不锈钢导管微量注射,然后在19:00,22:00及07:00的时间点测定饲料箱内饲料,分别计算3 h（19:00-22:00）及12 h（19:00-7:00）的摄食量。然后将发现具有生物活性的aFGF-（1-15）及[Ala16]aFGF-（1-29）两个片段经皮下注射,测定夜间摄食量。4、脑室内注射组织学监测实验结束后,用过量的戊巴比妥钠深麻醉大鼠,2%的美蓝溶液,用与前述注射药物同样的方法注入第三脑室内。然后用10%的中性甲醛溶液（100ml）,经左心室灌流后,取出脑组织,再在10%的中性甲醛溶液中固定一天以上,作前额断面的连续冰冻切片（50μm）,在显微镜下确认插入管头端的位置。结果:1、aFGF-（1-15）以每只大鼠200ng脑室内给与后对摄食没有影响,以每只大鼠400ng脑室内给与后减少了大鼠的夜间摄食量（3h:3.0±0.2 vs 2.1±0.2;12h:18.5±0.5 vs 16.1±0.5,P <0.01）。2、[Ala16]aFGF-（1-29）经脑室内注射,无论是在每只大鼠200ng（3h:4.9±0.2 vs 3.4±0.2;12h:19.3±1.2 vs 17.3±1.1,P <0.01）;还是每只大鼠400ng给药均减少了大鼠的夜间摄食量（3h:3.6±0.1vs 1.6±0.2;12h:19.9±0.8 vs 16.4±1.6,P <0.01）,并且与aFGF-（1-15）相比,[Ala16] aFGF-（1-29）抑制摄食作用更明显。3、其余五种aFGF片段脑室内注射无论每只大鼠200ng还是在每只大鼠400ng,对大鼠夜间摄食均没有影响。4、aFGF-（1-15）和[Ala16]aFGF-（1-29）以80、100、300μg/kg大鼠皮下注射,其中仅[Ala16]aFGF-（1-29）,300μg/kg皮下注射减少了大鼠的夜间摄食量（3h:3.9±0.2 vs 2.1±0.3;12h:19.8±0.5 vs 11.2±0.8,P <0.01）,其余种类和剂量对大鼠夜间摄食均没有影响。结论:1、aFGF氨基酸序列的N末端及用丙氨酸代替aFGF氨基末端中半胱氨酸残基对摄食调节发挥重要作用。2、第6位甘氨酸被右旋-色氨酸替代,第1位苯丙氨酸去氨基,第16位半胱氨酸被赖氨酸（ε-十四烷基）所代替,均没有摄食调节活性。3、部分活性片段外周给药同样可以发挥其生物活性。瘦素（Leptin）是一种主要由白色脂肪组织分泌的蛋白类激素,在调节摄食、体重、能量消耗和神经内分泌方面发挥着重要的作用。瘦素通过与瘦素受体（Ob-R）结合而发挥调节能量平衡、食物的摄入及胃肠运动功能。而摄食行为是由胃执行的,胃的运动控制摄食量。因此leptin如何调节胃肠运动并控制摄食量也是目前研究的一个重要课题。已经清楚,迷走运动背核（dorsal vagal complex,DVC）是中枢调节胃肠运动的重要部位,而下丘脑是调节DVC功能的上级中枢。许多研究显示leptin通过调节下丘脑阿黑皮素（proopiomelanocortin,POMC）表达从而改变摄食行为;那么,leptin、DVC和POMC三者与胃肠运动调节的关系如何?本研究就此课题进行了探讨。目的:本研究通过大鼠侧脑室注射leptin后观察:1、脑室内注射瘦素对大鼠胃肠运动的影响。2、脑室内注射瘦素对大鼠DVC上POMC表达的影响。3、其它可能存在的调节通路方法:1、动物饲养及分组雌性SD大鼠（180-220g）73只,在明暗各12小时（07:00-19:00）周期,22±2℃的室温环境,在一个笼中饲育一只大鼠。将大鼠随机分为对照组和leptin干预组,根据干预的时间再分为1,3,5h三个亚组,每组18只（脑室内固定组n=5,胃排空测定组n=7,小肠推进率组n=6）。2、侧脑室置管和瘦素的投予在10%水合氯醛麻醉下（0.3ml/100g,腹腔内注射）,将大鼠固定在脑立体定位仪上,根据大鼠脑图,从十字缝后方0.8mm,旁开1.5mm,深3.5mm,在颅盖骨上打开直径约2mm的洞,以不锈钢导管插入（长13.0mm,外径0,64mm,内经0.39mm）留置;用带帽的不锈钢制导丝（长12mm,直径0.33mm）,插入已经置入的不锈钢导管内用以封闭导管。大鼠禁食20-24小时后,在清醒无麻醉状态、稍微限制活动情况下每只老鼠从侧脑室注射leptin 3.5μg/μl。3、胃肠运动的检测予大鼠（n=28,每组n=7）500 mg/L酚红溶液2 ml灌胃,15 min后颈椎脱臼处死。剖腹,结扎贲门和幽门,取出整个鼠胃,沿胃大弯切开,以蒸馏水冲洗胃内容物,定容为20 ml。加入20 ml 0.5 mol/L NaOH搅拌混匀,静置1 h。取上清液,以分光光度计于560 nm波长处测定吸光度值。小肠推进率测定:大鼠（n=24,每组n=6）处死前15分钟按1m l/100g体重给予5%炭粉混悬液（活性炭和阿拉伯胶各5% ）灌胃,15min后颈椎脱臼处死,剖腹取出全部小肠并计算无张力下小肠推进指数。4、脑室内固定和免疫组织化学实验结束后,麻醉大鼠,开胸后经升主动脉插管行心脏灌注,先以0.9% NaCl溶液冲净血液,再以4%多聚甲醛灌注,待固定液灌注完毕后取脑组织。将组织包埋、切片,每张片厚5μm。用HE染色进行DVC的定位,用免疫组化方法测定OB-R和POMC在DVC的表达（每组n=5）。结果:1、胃排空率:瘦素给药1,3,5小时胃排空率分别为[（54.7±8.3）%]、[（54.6±9.3）%]、[（57.4±8.9）%],与对照组[（70.0±6.1）%]相比,P <0.05,差异有统计学意义,瘦素给药各亚组之间差异无统计学意义, P >0.05。小肠推进率:瘦素1,3,5小时小肠推进率分别为[（41.1±4.9）%]、[(49.5±13.6%]、[（43.6±5.5）%],与对照组[（43.0±6.3）%]相比,P >0.05,差异无统计学意义。2、免疫组化染色瘦素干预后Ob-R在DVC表达增多,而POMC的表达与对照组相比,差异无统计学意义,P >0.05。结论:1、本研究显示给大鼠侧脑室微量注射瘦素后抑制了大鼠的胃排空,对大鼠的小肠推进率却没有影响。2、不同于下丘脑弓状核,瘦素侧脑室注射后不能刺激DVC上POMC的表达增多,可直接刺激DVC上Ob-R的表达上调。
