Sonic hedgehog/PI3K/AKt信号通路在帕金森病炎症模型中发挥神经保护作用的研究

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本实验应用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠小胶质瘤细胞(BV2)建立小胶质细胞炎性激活模型,应用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)来模拟多巴胺能(DA)神经元。观察在PI3K/AKt信号通路抑制剂LY294002抑制该信号通路的情况下,Sonic hedgehog(SHH)信号通路激活剂2,6,9-三取代嘌呤化合物(Purmorphamine,PM)激活该通路后对LPS诱导的BV2细胞促炎因子、抗炎因子、帕金森相关基因Nurr1的表达以及其培养液对PC12细胞存活率的影响。进一步应用1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶(1-methy1-4-phenvl-1、2、3、6-tetrahvdropvridine,MPTP)来诱导小鼠帕金森病模型,LY294002鼻腔给药抑制PI3K/AKt信号通路后,观察PM腹腔注射激活SHH信号通路对小鼠行为学、小胶质细胞、炎症因子以及多巴胺能神经元的影响。为帕金森病的临床治疗和用药提供新的策略和理论依据。本实验分为体内和体外两部分实验。第一部分Sonic hedgehog/PI3K/AKt信号通路对帕金森病炎症细胞模型的影响目的:应用LPS刺激BV2细胞建立小胶质细胞炎症激活模型,探讨SHH信号通路的激活对LPS诱导BV2小胶质细胞的抑炎作用是否与PI3K/AKt信号通路有关。方法:应用LPS刺激BV2细胞诱导炎症反应,通过Western Bloting实验来检测炎症反应中PI3K/AKt信号通路的标志物P-AKt蛋白的表达情况以及SHH信号通路与PI3K/AKt信号通路的关系;应用LY294002处理BV2细胞来抑制PI3K/AKt信号通路后,通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,Q-PCR)来检测PM激活SHH信号通路对LPS诱导的BV2细胞的促炎因子IL-1β、TNF-a和抗炎因子TGF-β以及帕金森病相关基因Nurr1 m RNA的表达情况;通过CCK-8检测各组细胞培养液对PC12细胞存活率的影响。结果:1)Western Bloting实验显示:(1)与对照组相比,LPS诱导的炎症反应中有PI3K/AKt信号通路的抑制(P<0.01);(2)与LPS组相比,SHH信号通路的激活对LPS刺激下的P-AKt蛋白有上调作用(P<0.01;(3)与PM+LPS组相比,Cyclopamine抑制SHH信号通路后明显抑制SHH信号通路的上调P-AKt蛋白作用(P<0.01);2)Q-PCR结果显示:(1)与LPS组相比,PM激活SHH信号通路可以明显抑制炎症因子IL-1β、TNF-a和帕金森病相关基因Nurr1 m RNA的表达(均P<0.01),上调抗炎因子TGF-βm RNA的表达(P<0.01);(2)与PM+LPS组相比,LY294002预处理抑制PI3K/AKt信号通路后明显上调IL-1β、TNF-a m RNA的表达(均P<0.01),下调Nurr1、TGF-βm RNA的表达(均P<0.01);(3)与LPS组相比,LY+LPS组明显上调IL-1β、TNF-a以及TGF-βm RNA的表达(均P<0.01),明显抑制Nurr1 m RNA的表达(P<0.01);3)CCK-8结果显示:(1)与对照组相比,LPS组的上清培养液诱导的PC12细胞存活率显著下降(P<0.01);(2)与LPS组相比,PM+LPS组的培养液可以促进PC12细胞的存活率(P<0.01);(3)与PM+LPS组相比,LY294002+PM+LPS组培养液对PC12细胞的存活率有一定的抑制作用(P<0.05)。结论:1.炎症反应中有PI3K/AKt信号通路的抑制;2.SHH信号通路对PI3K/AKt信号通路有一定的调控作用;3.SHH信号通路的激活能降低LPS诱导的炎症反应,促进抗炎因子TGF-β的表达、抑制帕金森病相关基因Nurr1表达;4.SHH信号通路发挥的抑制炎症作用以及PC12细胞的保护作用与PI3K/AKt信号通路有关。第二部分Sonic hedgehog/PI3K/AKt信号通路对帕金森病模型中神经炎症、多巴胺能神经元以及行为学的影响目的:应用MPTP制作急性帕金森病模型,观察SHH信号通路的激活在帕金森病模型的神经炎症中发挥多巴胺能神经元的保护作用是否与PI3K/AKt信号通路有关。方法:MPTP造就急性PD模型,通过Western Bloting实验来检测PD模型中PI3K/AKt信号通路的表达情况以及体内SHH信号通路激活对PI3K/AKt信号通路的影响,LY294002(LY)鼻腔给药抑制PI3K/AKt信号通路后,PM腹腔注射激活体内SHH信号通路,通过悬挂实验检测小鼠行为学情况,免疫组织化学染色和Western Bloting实验来检测小胶质细胞和DA能神经元的表达情况以及Q-PCR检测相关炎症因子的表达情况。结果:1)Western Bloting(WB)结果显示:(1)与对照组相比,PD模型中有PI3K/AKt信号通路的抑制(P<0.01);(2)与MPTP组相比,SHH信号通路的激活对P-AKt蛋白有上调作用(P<0.01;(3)与PM+MPTP组相比,LY294002预处理后,能够明显抑制PI3K/AKt信号通路;2)Iba1免疫组织化学染色结果显示:(1)与对照组相比,PD模型黑质中小胶质细胞数量增多,胞体变大、染色深、突起变短增粗;(2)与MPTP组相比,PM+MPTP组的小胶质细胞数量减少,胞体小、突起细长;(3)LY+PM+MPTP组中的小胶质细胞的数量、大小、状态与MPTP组以及LY+MPTP组中的小胶质细胞类似;3)Iba1 WB结果显示:(1)与对照组相比,MPTP组Iba1蛋白表达明显上调(P<0.01);(2)与MPTP组相比,SHH信号通路的激活后明显下调Iba1蛋白表达,LY+MPTP组中的Iba1蛋白上调更显著(均P<0.01);(3)与PM+MPTP组相比,LY294002预处理可以改善SHH信号对Ibal蛋白的抑制作用(P<0.01);4)TH免疫组织化学染色结果显示:(1)与对照组相比,PD模型黑质中TH DA能神经元数量显著减少,胞体形态不完整,胞浆染色浅;(2)与MPTP组相比,PM+MPTP组的TH DA能神经元数量增多,胞体形态比较完整,轮廓清晰,胞浆染色深;LY+MPTP组中的TH DA能神经元数量稍减少,形态、着色相差不大;(3)与PM+MPTP组相比,LY+PM+MPTP组中的TH DA能神经元数量减少,形态不完整,着色浅;5)TH WB结果显示:(1)与对照组相比,MPTP组TH蛋白表达明显下降;(2)与MPTP组相比,PM+MPTP组的TH蛋白表达上调,LY+MPTP组中的TH蛋白下调;(3)与PM+MPTP组相比,LY294002明显抑制SHH信号的诱导的TH上调作用;6)Q-PCR结果显示:(1)与对照组相比,MPTP组的炎症因子IL-1β、TNF-a表达上调;(2)与MPTP组相比,PM+MPTP组的IL-1β、TNF-a表达下调,LY+MPTP组中的IL-1β、TNF-a表达上调;(3)与PM+MPTP组相比,LY294002明显抑制SHH信号的诱导的IL-1β、TNF-a的下调作用;7)悬挂实验显示:(1)与对照组相比,PD模型鼠悬挂时间得分明显降低(P<0.01);(2)与MPTP组相比,PM+MPTP组的小鼠悬挂时间得分明显升高(P<0.01);(3)与PM+MPTP组相比,LY294002抑制PI3K/AKt信号通路后能够明显抑制SHH信号的促悬挂时间得分(P<0.01)。结论:1.PD模型中有PI3K/AKt信号通路的抑制;2.体内SHH信号通路对PI3K/AKt信号通路有一定的调控作用;3.SHH信号通路的激活改善小鼠的运动协调能力、保护DA能神经元、抑制小胶质细胞的激活以及炎症因子的表达均与PI3K/AKt信号通路有关。
中文摘要第4-8页
Abstract第8-12页
中英文缩略词对照表第13-14页
前言第14-17页
第一部分 Sonic hedgehog/PI3K/AKt信号通路对帕金森病炎症细胞模型的影响第17-34页
    材料和方法第17-27页
    结果第27-34页
第二部分 Sonic hedgehog/PI3K/AKt信号通路对帕金森病模型中神经炎症、多巴胺能神经元以及行为学的影响第34-48页
    材料和方法第34-41页
    结果第41-48页
讨论第48-52页
结论第52-53页
参考文献第53-57页
综述第57-67页
    参考文献第64-67页
攻读学位期间所取得的研究成果第67-68页
致谢第68-69页
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