东乡野生稻宿根cDNA文库的构建和功能基因的筛选

水稻是重要的粮食作物,水稻生产关乎国民经济的安全和稳定。每年冷害和其他环境胁迫都会造成水稻大幅减产,通过品种改良增加水稻的抗逆性可使水稻免受环境胁迫损伤,从而保证水稻的高产稳产。东乡野生稻是目前发现的分布最北能越冬的普通野生稻,具有强耐寒性和耐受其他环境胁迫能力。为克隆江西东乡野生稻耐寒和其它有利功能基因,本研究采用了SMART技术,提取冬季东乡野生稻宿根总RNA,合成cDNA的第1链,再经LD-PCR扩增合成第2链获得双链cDNA。然后,采用CHROMA柱分离收集cDNA中较长cDNA片段。通过连接λ噬菌体载体和载体包装,转染大肠杆菌,获得冬季东乡野生稻根质粒cDNA文库。经测定,原始文库滴度平均为2.9×106cfu/mL,平均插入片段约0.8kb,重组率为99.5%以上,cDNA文库质量符合要求。cDNA文库经测序鉴定基因序列1000余个；经生物信息学分析表明,这些基因具有抗逆功能和其它相关功能,包括锌指蛋白、类PBZ1蛋白、ABA诱导蛋白、金属硫蛋白、蛋白酶抑制剂等。测序结果中155号DNA序列推测为锌指蛋白基因,具有转录因子功能,编码188aa,分子量24.4kD,初步分析蛋白结构为C2H2类锌指蛋白；通过设计PCR引物,扩增获得基因全长,双酶切后连接至pET28a原核表达载体中,成功构建pET28a-155表达载体。为深入研究东乡野生稻的冷信号转导机制,根据日本晴CBF-3基因序列设计引物,以东乡野生稻叶基因组DNA为模板,PCR法克隆获得东乡野生稻类CBF-3序列,结果表明东乡野生稻CBF-3DNA序列与日本晴的序列相同。本研究为通过构建东乡野生稻根cDNA文库,筛选获得大量的抗逆和其它相关功能基因,成功构建pET-28(a)-155原核表达载体并克隆获得了东乡野生稻CBF-3基因序列,为后续研究江西东乡野生稻有利基因的功能奠定了坚实基础。