粒径大小和炮制方法对纳米雄黄抗肿瘤活性影响的研究

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雄黄(主要成分为As2S2或As4S4)作为我国一种重要的传统中药,已有记载的使用历史达1500余年。尤其是近年来其对慢性粒细胞白血病(CML)和急性早幼粒细胞白血病(APL)表现出的良好治疗效果得到了世界的广泛关注。然而,溶解性差以及由此导致的生物利用度低和毒副作用较强是雄黄应用中面临的主要挑战。雄黄的纳米化被证明可在一定程度上提高雄黄的溶解性和生物利用度,但过程往往导致过高的氧化砷含量和毒副作用。同时,对纳米雄黄抗肿瘤过程的粒径效应至今缺乏深入的认识。炮制是降低中药毒性或副作用的常用手段之一。为此,本研究将以国内外的最新研究进展为基础,重点开展纳米雄黄(NR)的粒径大小和炮制过程对其抗肿瘤活性的影响。实验采用高能球磨法制备NR,研究了球磨过程中助磨剂的种类、使用量以及球磨时间等对雄黄粒径的影响规律。进一步以人肝癌细胞HepG-2、人骨肉瘤细胞MG-63和人正常肝细胞L-02细胞为体外模型,研究了NR粒径大小对其抗肿瘤活性的影响。在此基础上,采用传统的炮制方法(水飞法、水洗法、酸洗法和碱洗法)对NR进行处理,研究不同的炮制工艺对NR粒径大小、表面性质、As2O3的含量以及抗肿瘤活性的影响。结果表明,助磨剂和球磨时间对NR的粒径有显著的影响。以饱和十二烷基硫酸钠(SDS,2.48g/L)为助磨剂,12h后得以制备出平均粒径为127 nm的NR。球磨前后,雄黄的物理和化学性能并未发生明显变化,但球磨后雄黄中As2O3的含量明显增加,且ZETA电位值由球磨前的0.83 eV变为-17.85eV。MTT实验结果表明,相比于原料雄黄,球磨后制得的NR对HepG-2和MG-63两种肿瘤细胞的毒性抑制作用大大增强,而且这种毒性作用随着作用时间的延长以及NR浓度的增加而增大。相比之下,HepG-2细胞对雄黄的毒性的敏感程度要稍强于MG-63。同时,随着雄黄颗粒粒径的减小,NR对HepG-2和L-02细胞的毒性抑制作用均增强,表现出粒径依赖性,而且NR对HepG-2细胞的毒性抑制作用明显高于L-02细胞。经过不同方法炮制后的NR粒径变化较小(水飞法除外),但其As2O3含量不同程度地下降,从而导致对肿瘤细胞的毒性作用也相应地降低。而水飞法炮制后得到的NR具有最小的粒径和最低的As2O3,表现出与未炮制NR相当的抗肿瘤活性,且对L-02细胞的毒性降低。从以上的结论可以预料的到在实际临床应用中NR的抗肿瘤效果要优于普通雄黄,而炮制后的NR其毒性降低,可以从一定程度上减少治疗过程中的毒副作用。
摘要第5-6页
Abstract第6-7页
引言第11-13页
第1章 文献综述第13-29页
    1.1 纳米技术在生物医学领域的应用第13-15页
        1.1.1 纳米技术简介第13页
        1.1.2 纳米技术在生物医学领域的应用第13-15页
    1.2 纳米中药第15-17页
        1.2.1 纳米中药及其分类第15-16页
        1.2.2 纳米中药的特点第16-17页
    1.3 纳米中药的制备第17-18页
    1.4 纳米粉碎理论第18-20页
    1.5 雄黄的临床应用现状第20-21页
    1.6 雄黄抗肿瘤作用机理的研究第21-23页
        1.6.1 诱导肿瘤细胞的凋亡第21-23页
        1.6.2 抑制核酸生成第23页
        1.6.3 促进肿瘤细胞分化第23页
        1.6.4 作为血管内皮细胞抑制剂第23页
        1.6.5 直接杀瘤作用第23页
    1.7 雄黄临床应用中面临的问题第23-24页
    1.8 NR的研究进展第24页
    1.9 雄黄炮制第24-27页
        1.9.1 中药雄黄传统降毒方法的研究第24-25页
        1.9.2 中药雄黄炮制新方法的研究第25-27页
        1.9.3 总结第27页
    1.10 本课题选题意义、研究目标及研究内容第27-29页
        1.10.1 选题意义第27页
        1.10.2 研究目标第27页
        1.10.3 研究内容第27-29页
第2章 纳米雄黄的制备及其物化性能的表征第29-45页
    2.1 引言第29-30页
    2.2 仪器与试剂第30页
    2.3 实验方法第30-35页
        2.3.1 雄黄球磨粉碎工艺的优化第30-31页
        2.3.2 NR物理化学性能的表征第31-33页
        2.3.3 雄黄中As_2O_3含量的测定第33-35页
    2.4 结果与讨论第35-44页
        2.4.1 不同类型的助磨剂对NR粒径的影响第35-37页
        2.4.2 不同的球磨时间对NR粒径的影响第37-39页
        2.4.3 球磨前后雄黄物理化学性能的变化第39-41页
        2.4.4 雄黄中As_2O_3含量和表面电荷的变化第41-44页
    2.5 本章小结第44-45页
第3章 不同粒径大小对纳米雄黄抗肿瘤活性的影响第45-58页
    3.1 引言第45页
    3.2 实验材料第45-48页
        3.2.1 细胞株第45页
        3.2.2 生化试剂第45-48页
    3.3 仪器与设备第48页
    3.4 常用试剂及配制第48-49页
    3.5 常用方法第49-52页
        3.5.1 实验相关器材灭菌第49页
        3.5.2 细胞培养方法第49-51页
        3.5.3 细胞计数方法第51页
        3.5.4 细胞活性MTT实验第51页
        3.5.5 Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪测试第51-52页
    3.6 实验结果及讨论第52-57页
        3.6.1 MTT实验结果及讨论第52-55页
        3.6.2 NR诱导HepG-2细胞的凋亡第55-57页
    3.7 本章总结第57-58页
第4章 炮制过程对NR性能的影响第58-64页
    4.1 引言第58页
    4.2 常用试剂第58-59页
    4.3 实验方法第59页
        4.3.1 NR的炮制第59页
        4.3.2 NR物化性能的测试第59页
        4.3.3 NR抗肿瘤活性研究第59页
    4.4 实验结果及讨论第59-63页
    4.5 本章小结第63-64页
全文总结及课题延伸第64-66页
    1 全文总结第64-65页
    2 课题延伸第65页
    3 本文创新点第65-66页
参考文献第66-72页
致谢第72-73页
研究生在读期间发表的论文第73页
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