急性颅脑创伤患者脑脊液差异蛋白质组学研究

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目的:重型颅脑创伤(traumatic brain injury, TBI)患者死亡率很高,在30%-50%左右,存活者中也有相当高的致残率,因此,颅脑创伤严重威胁着人类健康,对社会和家庭造成沉重的经济负担,引起了世界各国的广泛重视。目前如何降低该病的死亡率和致残率仍是神经外科领域的难点和热点,对其致病和修复机制的研究,一直是神经外科领域的热点课题。在前期研究中,我们通过承担国家自然科学基金资助项目《急性脑创伤后神经元蛋白质组农达改变的研究》(项目编号:30271331),采用蛋白质组学技术平台,观察了创伤后大脑皮层神经组织内蛋白质组的变化。本研究目的是通过比较脑创伤后脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)蛋白组的改变,从中寻找脑源性差异蛋白,并与脑组织蛋白质组改变进行比较,为研究颅脑创伤的分子机制和生物学标志物的寻找提供宝贵的理论基础。方法:在第一部分,我们选用从10例人脑创伤后行颅内压监护的患者中获取的脑脊液,通过预冷丙酮除盐浓缩,采用蛋白质均衡技术(ProteoMinerTM试剂盒)去除高丰度蛋白并富集低丰度蛋白之后,进行双向凝胶电泳、硝酸银染色和凝胶图像处理,建立了高重复性的人类脑脊液蛋白质组中的高丰度蛋白去除方法,进行了方法学上的验证。在第二部分,我们选取30例颅脑创伤患者和8例破裂动脉瘤致蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)但不伴实质内血肿的患者,发病后24小时内行脑室外引流术,收集的脑脊液样本离心取上清-80℃低温保存,混合样本预冷丙酮除盐浓缩,采用ProteoMinerTM试剂盒去除高丰度蛋白并富集低丰度蛋白后,Bradford法测定最终蛋白浓度,由三种荧光(Cy2, Cy3, Cy5)交叉标记的两种50μg样品和内标混合,进行双向差异凝胶电泳(two-dimensional differential in-gel electrophoresis,2D-DIGE),使用DeCyder v.5.02图像分析软件分析电泳结果。差异点通过胰蛋白酶胶内酶切、基质辅助激光解吸/电离-飞行时间串联质谱技术,对肽段的分子量进行测定,通过数据库检索,进行蛋白鉴定,推测其生物学作用。结果:在第一部分中,人TBI后CSF经ProteoMinerTM处理后,经过PDQuest 7.0软件自动检测到的蛋白质点数为1432±85,与常用的丙酮沉淀法检测到的蛋白质点数1123±114相比,具有统计学意义(P<0.05, F=8.885)。通过比较CSF经ProteoMinerTM处理前后2-DE图谱发现,高丰度蛋白减少,低丰度蛋白的分辨率提高。说明ProteoMinerTM起到了富集低丰度蛋白的作用,可进行下一步研究。在第二部分的研究中,两组患者的CSF经过ProteoMinerTM富集低丰度蛋白后进行2D-DIGE分离,得到清晰的脑脊液蛋白图谱。生物学差异分析结果表明,在外伤组与对照组脑脊液蛋白共存在有表达量变化超过1.5倍的差异蛋白质点169个,其中在外伤组中表达上调1.5倍以上的有98个蛋白质点,下调1.5倍以上的有71个蛋白质点。通过质谱鉴定,47个蛋白质点被鉴别出,属于36种蛋白产物。依据蛋白可能存在的生理功能将其分类为:细胞骨架、参与代谢、信号传导、应激反应、蛋白合成与代谢和未知功能蛋白。其中铜蓝蛋白、小白蛋白、KLF6因子、磷脂转运蛋白、SLC25A23、溴区包含蛋白1、F-box蛋白7与中枢神经系统常见疾病有密切关系,在脑创伤急性期内人CSF中首次发现其表达水平出现变化。结论:人脑创伤后的急性期内,创伤造成的机械破坏使脑脊液蛋白质组发生明显变化,为研究颅脑创伤及其他神经系统疾病提供了最佳窗口。蛋白质均衡技术可以提高双向电泳的分辨率,有利于低丰度蛋白质的检出。伤后蛋白表达水平的升高或降低同时存在,在本次研究中发现的具有显著性差异变化的蛋白中,尽管还需要进一步的验证,但有可能成为评价损伤程度、预测预后的生物学标志物。
摘要第4-6页
Abstract第6-8页
目录第9-11页
缩略语/符号说明第11-14页
前言第14-18页
    研究现状、成果第14-15页
    研究目的、方法第15-18页
一、人脑脊液蛋白质组研究中的高丰度蛋白去除方法的建立和评价第18-50页
    1.1 对象和方法第18-35页
        1.1.1 样本采集与保存第18页
        1.1.2 主要实验仪器第18-20页
        1.1.3 主要试剂第20-26页
        1.1.4 实验方法第26-35页
    1.2 结果第35-39页
        1.2.1 蛋白定量结果第35页
        1.2.2 ProteoMiner~(TM)离心柱处理前后脑脊液蛋白SDS-PAGE图谱第35-36页
        1.2.3 人脑脊液蛋白质组双向电泳图谱第36-38页
        1.2.4 CSF经ProteoMiner~(TM)处理前后检测到的蛋白质点数第38-39页
    1.3 讨论第39-49页
        1.3.1 溶剂沉淀法第42页
        1.3.2 亲和吸附法第42-43页
        1.3.3 固相萃取法第43-44页
        1.3.4 免疫抗体吸附法第44-45页
        1.3.5 亲和体分了第45-46页
        1.3.6 肽亲和微珠第46-49页
    1.4 小结第49-50页
二、急性颅脑创伤后人脑脊液差异蛋白质组学研究第50-92页
    2.1 对象和方法第51-62页
        2.1.1 主要实验仪器第55页
        2.1.2 主要试剂第55页
        2.1.3 实验方法第55-62页
    2.2 结果第62-73页
        2.2.1 2D-DIGE图谱分析第62-67页
        2.2.2 差异点在脑脊液蛋白质2-D DIGE图像中的分布第67页
        2.2.3 颅脑创伤患者与对照组比较的差异表达蛋白质第67-71页
        2.2.4 差异蛋白质谱鉴定第71-73页
    2.3 讨论第73-90页
        2.3.1 对照组的设置第74-76页
        2.3.2 方法学的改进第76-78页
        2.3.3 本研究发现有明显差异表达的脑脊液蛋白质第78-90页
    2.4 小结第90-92页
全文结论第92-94页
论文创新点第94-95页
参考文献第95-107页
发表论文和参加科研情况说明第107-108页
附录一第108-112页
附录二第112-123页
综述 中枢神经系统疾病脑脊液蛋白质组学研究进展第123-145页
    综述参考文献第136-145页
致谢第145页
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