雄性半滑舌鳎GH//IGF-I轴相关基因SNP和DNA甲基化与生长的相关性研究
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本文以人工养殖的雄性半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)个体为实验对象,首次分析了GHR基因突变位点及其甲基化状态对激素、生长性状及基因表达的影响机理;并对GH基因的编码区及其启动子区域的多态性与生长性状相关性进行了研究和分析。1雄性半滑舌鳎GHR基因多态性及与生长性状相关性分析GHR是一种细胞表面受体,对GH功能的发挥具有必不可少的作用。本文的目的是检测GHR基因的多态性并分析其与激素水平和生长性状的相关性。结果显示:在GHR基因检测到两个单核苷酸多态性:SNP1[c.G1357A(p. Val376Ile)]位于外显子8,称为L1位点;SNP2(c.G1479A)位于外显子9,称为L2位点。单因素方差分析显示只有L1与性腺重(P≤0.05)、体重(P<0.01)和激素水平(P≤0.05)呈相关性。通过多重比较显示,AA和AG基因型个体的体重和T3水平显著高于GG基因型个体;AA和AG基因型个体的性腺重显著低于GG基因型个体。这表明GHR基因编码区突变进可能影响雄性半滑舌鳎的生长状态,并且L1位点可以作为半滑舌鳎的一个遗传标记。2雄性半滑舌鳎肝脏GHR基因甲基化水平及基因表达水平分析表观遗传修饰特别是DNA甲基化,对基因的表达具有重要的调控作用。本实验研究了GHR基因外显子8区域的甲基化状态并探索了其对基因表达的影响。经亚硫酸修饰,由于L1位点突变,使GG基因型较AA和AG基因型多一个CpG位点,且此甲基化位点高度甲基化,其他两个CpG位点在三种基因型中没有差别。经实时定量荧光PCR检测三种基因型的GHR基因的相对表达量。通过多重比较,AA基因型和AG基因型个体的基因表达水平极显著高于GG基因型个体。基于本研究,提出GHR基因外显子8区域CpG位点的甲基化状态可能影响GHR基因的转录水平,结果为半滑舌鳎生长生理机理提供表观遗传学的理论支持。3雄性半滑舌鳎GH基因的编码区及其启动子多态性及与生长性状相关性分析实验分析了GH基因编码区及其启动子区域的多态性,同时对各基因型与其体重、体长和激素水平等进行了关联性分析。结果显示GH基因编码区有两个SNP: SNP1[c.C382T (p.Phe106Leu)],位于外显子4,命名为L3位点;SNP2[c.C235T (p.Arg57Cys)],位于外显子3,命名为L4位点。按照数理统计的要求,经过单因素方差分析,L3位点与体重(P≤0.05)、去内脏重(P≤0.05)和T3水平(P<0.01)呈显著相关。多重比较的结果显示,CC基因型个体的体重、去内脏重和T3水平显著高于TT基因型个体。通过蛋白质结构分析,发现L3位点的突变使蛋白质结构发生了改变。这些结果表明半滑舌鳎GH基因的突变可以影响其激素水平和生长性状,L3位点可以用作分子标记,从遗传学的角度阐释GH基因对生长生理的调控机制。尽管在启动子区域没有发现突变,但预测出其启动子包含了许多CpG位点,这可能为寻找半滑舌鳎的表观遗传标记奠定基础.综上所述,本研究对半滑舌鳎GHR基因编码区多态性及甲基化状态进行检测,并对GH基因编码区及其启动子区域SNP进行分析,此研究结果初步表明,GH/IGF-I轴上相关基因SNP和甲基化状态与生长状态呈显著相关,本研究对鱼类生长调控分子机理具有参考价值。
摘要 | 第5-7页 |
Abstract | 第7-8页 |
前言 | 第12-14页 |
第一章 文献综述 | 第14-24页 |
1 单核苷酸多态性研究 | 第14-17页 |
1.1 单核苷酸多态性的发生和特点 | 第14-15页 |
1.1.1 单核苷酸多态性的发生 | 第14-15页 |
1.1.2 单核苷酸多态性的特点 | 第15页 |
1.2 单核苷酸多态性的检测方法 | 第15-16页 |
1.2.1 直接测序法 | 第15页 |
1.2.2 以构象为基础的检测法 | 第15-16页 |
1.2.3 基于PCR、酶切的检测法 | 第16页 |
1.2.4 基于杂交的检测方法 | 第16页 |
1.3 单核苷酸多态性在水产动物遗传育种研究中的应用 | 第16-17页 |
2 DNA甲基化研究 | 第17-21页 |
2.1 DNA甲基化与基因的表达调控 | 第17-18页 |
2.1.1 DNA甲基化修饰 | 第17-18页 |
2.1.2 DNA甲基化表达调控机制 | 第18页 |
2.2 甲基化研究方法学 | 第18-19页 |
2.3 DNA甲基化在鱼类中的研究进展 | 第19-20页 |
2.3.1 DNA甲基化在胚胎发育中的作用 | 第19页 |
2.3.2 影响DNA甲基化模式的因素 | 第19-20页 |
2.4 DNA甲基化与分子标记 | 第20-21页 |
3 鱼类GH/IGF-I轴相关基因SNP和DNA甲基化研究 | 第21-23页 |
3.1 鱼类GHR基因SNP和DNA甲基化研究进展 | 第21-22页 |
3.2 鱼类GH基因SNP研究进展 | 第22页 |
3.3 鱼类GH基因启动子SNP研究进展 | 第22-23页 |
4 本研究的立项依据与研究意义 | 第23-24页 |
第二章 雄性半滑舌鳎GHR基因多态性及与生长性状相关性分析 | 第24-34页 |
1 材料和方法 | 第24-28页 |
1.1 主要实验试剂 | 第24-25页 |
1.2 实验鱼和数据获取 | 第25页 |
1.3 血浆中激素含量的测定 | 第25-26页 |
1.4 基因组DNA的提取 | 第26页 |
1.5 PCR-SSCP检测 | 第26页 |
1.6 数据分析 | 第26-28页 |
2 结果 | 第28-32页 |
2.1 基因组DNA提取结果 | 第28页 |
2.2 GHR基因外显子的多态性 | 第28-30页 |
2.2.1 GHR外显子的PCR扩增结果 | 第28-29页 |
2.2.2 SSCP、硝酸银染色及测序结果 | 第29-30页 |
2.3 两个SNP位点与所测性状的相关性分析 | 第30-32页 |
3 讨论 | 第32-33页 |
4 小结 | 第33-34页 |
第三章 雄性半滑舌鳎GHR基因突变位点的甲基化水平及基因表达水平分析 | 第34-45页 |
1 材料和方法 | 第34-37页 |
1.1 实验鱼 | 第34页 |
1.2 基因组DNA提取 | 第34-35页 |
1.3 基因组DNA的亚硫酸转化 | 第35-36页 |
1.4 甲基化特异性PCR | 第36页 |
1.5 RNA提取、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) | 第36-37页 |
1.6 实时定量PCR | 第37页 |
2 结果 | 第37-42页 |
2.1 基因组DNA提取结果 | 第37-38页 |
2.2 DNA甲基化水平 | 第38-40页 |
2.2.1 特异性甲基化PCR扩增结果 | 第38页 |
2.2.2 L1三种基因型扩增产物测序结果 | 第38-39页 |
2.2.3 L1三种基因型甲基化比率 | 第39-40页 |
2.3 GHR基因表达水平 | 第40-42页 |
2.3.1 目的基因(GHR)与内参基因(β-actin)的扩增效率 | 第40-41页 |
2.3.2 标准曲线 | 第41-42页 |
2.3.3 L1位点与肝脏中GHR基因表达的相关性分析 | 第42页 |
3 讨论 | 第42-44页 |
4 小结 | 第44-45页 |
第四章 雄性半滑舌鳎GH基因的编码区及其启动子多态性及与生长性状相关性分析 | 第45-56页 |
1 材料和方法 | 第46-47页 |
1.1 主要实验试剂 | 第46页 |
1.2 实验鱼和数据获取 | 第46页 |
1.3 血浆中激素含量的测定 | 第46页 |
1.4 PCR-SSCP检测 | 第46-47页 |
1.5 数据分析 | 第47页 |
1.6 蛋白质结构预测 | 第47页 |
1.7 转录因子预测 | 第47页 |
2 结果 | 第47-54页 |
2.1 GH基因外显子及其启动子区域的多态性 | 第47-51页 |
2.1.1 PCR扩增结果 | 第47-49页 |
2.1.2 SSCP、硝酸银染色及测序结果 | 第49-51页 |
2.2 SNP位点与所测性状的相关性分析 | 第51-52页 |
2.3 突变前后蛋白质结构 | 第52-53页 |
2.4 转录因子预测结果 | 第53-54页 |
3 讨论 | 第54-55页 |
4 小结 | 第55-56页 |
参考文献 | 第56-64页 |
附录 | 第64-65页 |
致谢 | 第65-66页 |
个人简历 | 第66页 |
发表的学术论文 | 第66-67页 |
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