目的纤维介素蛋白(fgl2)在重型病毒性肝炎发生发展中发挥较为重要的作用,本课题旨在探索人纤维介素蛋白(hfgl2)的发夹状双链RNA(shRNA)在体外对hfgl2基因表达的干扰作用规律,为重型病毒性肝炎的基因治疗提供新的思路。方法构建hfgl2真核表达载体pcDNA3.1-hfgl2、hfgl2-EGFP融合基因表达质粒pEGFP-hfgl2和hfgl2 shRNA的表达质粒p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2shRNA2。将pEGFP-hfgl2和hfgl2 shRNA的表达质粒共转染到CHO细胞,作为试验组,另将仅转染pEGFP-hfgl2或共转染无关序列shRNA表达质粒和pEGFP-hfgl2作为对照组。转染24、48 h后,荧光显微镜下观察hfgl2-EGFP融合蛋白在CHO细胞中的表达情况,以判断融合蛋白表达受到干预的情况。结果1.通过PCR、酶切和核苷酸测序表明:成功地构建了hfgl2真核表达载体pcDNA3.1-hfgl2,将该质粒转染CHO细胞,细胞爬片免疫组织化学染色可见胞浆中存在明显的阳性棕染。2.通过PCR、酶切和核苷酸测序表明:成功地构建了hfgl2-EGFP融合基因表达质粒pEGFP-hfgl2,该质粒在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中可以表达hfgl2-EGFP融合蛋白,可通过荧光显微镜观察到绿色荧光。3.通过PCR、酶切和核苷酸测序表明:成功地构建了hfgl2shRNA表达质粒p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2shRNA2,构建的质粒在细胞内可以产生发夹状双链RNA,双链部分长19bp,序列与hfgl2mRNA的一段基因序列一致。4.本研究所设计并构建的hfgl2shRNA表达质粒能特异有效地抑制CHO细胞内hfgl2-EGFP融合蛋白的表达。结论本研究hfgl2靶点序列的选择是成功的,基于靶点序列设计并构建的hfgl2shRNA表达质粒p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2shRNA2可在体外实验中有效特异地抑制hfgl2的表达,为进一步干预实验奠定了基础。本研究的意义由于fgl2在重型病毒性肝炎发生发展中发挥较为重要的作用,应用RNA干扰技术对fgl2的表达进行阻断,将有可能延缓甚至阻断重型肝炎的进一步发展,提高患者生存率,本研究所设计并构建的hfgl2shRNA表达质粒在体外表现出明显的干预hfgl2表达的作用,为探索人类重型肝炎的基因治疗提供了新的思路。
