一氧化氮对桃果实ETR1蛋白原核表达及李果实线粒体膜氧化损伤的影响

本文分为两部分,第一部分内容是对桃果实中的乙烯受体蛋白进行原核表达,并优化了蛋白表达条件,初步探索了NO对乙烯受体基因转录表达的影响;第二部分内容研究了一氧化氮（NO）对采后李果实线粒体膜氧化的影响。克隆了与肥城桃成熟有关的乙烯受体ETR1基因片段,获得ETR1重组蛋白并优化ETR1的表达条件,为进一步研究ETR1功能并改善肥城桃贮运性能奠定基础。以肥城桃成熟果实总RNA反转录cDNA为模板,经PCR扩增到一条约2500 bp的特异片段,将该片段克隆到pEASY-T1上,经BamHⅠ和NdeⅠ双酶切后,克隆到pET15b并转染Ecoli C43（DE3）,IPTG诱导表达ETR1重组蛋白并优化其表达条件。序列分析结果表明,该序列与GenBank中的AF124527的cDNA序列同源性99%,氨基酸序列同源性99%。诱导ETR1重组蛋白的优化条件为:大肠杆菌选用C43（DE3）,IPTG的终浓度为0.5 mmol·L-1,适宜诱导温度为30 oC,适宜诱导时间为8 h。在本实验优化的条件下,ETR1重组蛋白在大肠杆菌C43（DE3）中的成功表达,为ETR1的重组生产和对ETR1功能的体外研究提供了条件。随着NO浓度的增加,对ETR1基因表达的抑制作用也更加显著。分别用0、10、15、30μL·L-1 NO处理李果实,测定25℃贮藏13 d内果实呼吸速率、活性氧（ROS）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性、线粒体通透性转换孔开放程度、膜电位、膜流动性、细胞色素（Cyt） c/a的变化。与对照和其它NO处理相比,15μL·L-1 NO提高了果实中SOD、CAT和POD活性,有效减少了果实中氢过氧化物和超氧阴离子自由基等ROS的含量,抑制了线粒体通透性转换孔的开放,延缓了线粒体膜通透性的升高和Cyt c的释放,维持了较高的膜电位。随着浓度升高,30μL·L-1 NO对线粒体膜的保护作用降低。