中国野生葡萄再生体系研究及抗病相关基因(VpGLOX、VpPR17、VpHSF1)的克隆与功能分析

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葡萄作为世界重要经济水果,病害是引起葡萄减产的重要原因,用化学防治的方法增加生产成本,降低葡萄的品质。利用抗病资源培育抗病品种是解决这一问题的有效途径。我国野生葡萄资源对主要葡萄病害有较强的抗性。利用中国野生葡萄资源进行抗病育种具有重要意义。本研究一方面针对中国野生葡萄再生率低的问题,进行了茎尖培养及再生的研究;另一方面,在前期研究的基础上,分析乙二醛氧化酶基因的功能,并利用同源克隆等方法克隆分析了病程相关蛋白基因以及热激转录因子的功能,旨在于更好保护利用中国野生葡萄资源,进一步揭示中国野生葡萄抗病机制,研究取得以下主要研究结果。1、从初代培养、增殖培养、生根培养三个阶段研究了影响华东葡萄株系‘白河-35-1’茎尖组织培养的因素,重点研究了不同盐浓度、不同生长调节物质种类与浓度、糖浓度、不同抗氧化剂及接种材料对组培‘白河-35-1’生根培养的影响。结果表明:较适宜的初代培养基为MS+0.2mg.L-1IBA+0.5~1mg.L-1BAP;增殖过程中用MS+1.0mg.L-1BAP+0.1mg.L-1NAA取得较的增殖效果;生根培养较好的培养基为:1/2MS+琼脂6g.L-1+IBA0.2mg.L-1+活性碳1g.L-1。2、用‘白河-35-1’的叶片等材料为外植体进行了器官再生的研究,结果表明:用叶片为外植体的不定芽再生率比叶柄和茎段为外植体的再生率高,在接种后10d出现愈伤组织,40d出现再生芽,再生芽多为丛生芽。‘白河-35-1’叶片再生适宜的基本培养基为MS培养基,适宜的分裂素为TDZ,浓度为2.0㎎.L-1,适宜的生长素为NAA,浓度为0.1㎎.L-1。经过液体培养的材料,其叶片再生率比一般继代培养的叶片高,再生诱导时先形成为胚性愈伤,进而形成叶状结构,最后得到再生芽。3、用了8种中国野生葡萄10个株系以及2种欧洲葡萄雄蕊和雌蕊进行了胚状途径再生的研究,其中华东葡萄V.pseudoreticulata W.T.Wang的2个株系‘白河-35-2’和‘广西-2’,刺葡萄V. davidii株系‘宁强-6’,及欧洲葡萄Vitis vinifera L2个品种‘雷司令’和‘梅尔诺’获得了胚状体,雄蕊为外植体时胚状体诱导率比雌蕊为外植体高,MSC培养基胚状体诱导率比其他3种培养基效果好,愈伤组织诱导率的高低与胚状体诱导率高低没有直接关系。NN69为基本培养基、用植物凝胶为凝固剂有利于中国野生葡萄胚状体诱导。4、在前期研究的基础之上,进一步分析了乙二醛氧化酶基因(VpGLOX)的功能,用qRT-PCR分析了VpGLOX在抗病株系‘白河-35-1’以及感病株系‘佳利酿’中受白粉病诱导表达的情况,在2种葡萄基因型中VpGLOX的表达均受葡萄白粉病的诱导,在抗病基因型‘白河-35-1’中接种后基因表达量变化量大于感病基因型,表达量比同时期感病型基因高。构建了该基因的表达载体和干扰载体,进行烟草遗传转化,获得了4株过量表达的转基因烟草,转基因烟草中乙二醛氧化酶含量以及H2O2含量增加,转基因烟草对烟草疫霉病的抗性增加。用瞬时转化的方法,对转入的VpGLOX进行干扰处理,干扰处理后的植株乙二醛氧化酶含量下降,但H2O2含量无明显变化。5、采取同源克隆的方法,从‘白河-35-1’叶片cDNA中克隆得到葡萄病程相关蛋白VpPR17(GenBank登录号:JQ248075),并用生物信息学的方法分析了该基因编码氨基酸序列的一些特点。该基因开放阅读框有681个碱基,编码226个氨基酸,等电点(PI)为:6.30,分子量为25.41kDa,有信号肽。VpPR17编码蛋白序列与马铃薯、烟草的病程相关蛋白27相似性分别为70%和71%,亚细胞定位结果表是明:VpPR17在细胞质中表达,有的细胞器中多些。qRT-PCR分析表明,在抗病株系‘白河-35-1’中VpPR17的表达基本不受白粉病诱导而在感病品种‘佳利酿’中白粉病接种后变化很明显。将VpPR17连入原核表达载体pGEX-6T-1,转入E.coli BL21中,经IPTG诱导后重组菌在约50kDa的位置出现一特异条带,说明VpRFP1基因在表达菌E.coli BL21中得到表达,其蛋白粗提液有抑菌活性。通过农杆菌瞬时转化法将VpPR17转入‘白河-35-1’叶片,后接种霜霉菌,经转化的叶片在接种后的3、5、9d的叶片菌丝的发展速度明显少于对照,说明VpPR17与植物抗病相关。6、利用RACE技术从中国野生葡萄华东葡萄cDNA中克隆得到1个葡萄热激转录因子,命名为VpHsf1(GenBank登录号为:GU393313),cDNA全长1428bp,开放阅读框为918bp,VpHsf1编码305个氨基酸,预测蛋白质分子约33.7kD和估算等电点为5.09,同源对比表明:VpHsf1属于HSF B类家族,VpHsf1具有核定位功能。在葡萄中,VpHsf1的表达受病原菌、高温和干旱所诱导。qRT-PCR分析表明,在抗病株系‘白河-35-1’以及感病株系‘佳利酿’中VpHsf1的表达均受葡萄白粉病的诱导,与感病品种不同是,在抗病基因型中,表达量较低。烟草中过量表达VpHsf1降低了烟草的耐热性,而增加了获得耐热性,转基因烟草对烟草黑胫病更为敏感,也降低了烟草抵抗渗透胁迫的能力。总之,VpHsf1与葡萄的生物和非生物胁迫有关。
摘要第6-8页
ABSTRACT第8-10页
第一章 文献综述第15-23页
    1.1 葡萄的离体培养第15-16页
    1.2 葡萄的再生第16-18页
    1.3 植物的抗病性第18页
    1.4 乙二醛氧化酶基因相关研究第18-19页
    1.5 植物病程相关蛋白相关研究第19页
    1.6 植物热激转录因子的相关研究第19-21页
    1.7 本研究的目的和意义第21-23页
第二章 中国野生华东葡萄‘白河-35-1’茎尖培养体系的研究第23-31页
    2.1 材料与方法第23-25页
        2.1.1 无菌培养体系的建立第23页
        2.1.2 不同的激素处理对组培苗增殖的影响第23-24页
        2.1.3 MS 中不同无机盐浓度对组培苗生长及生根的影响第24页
        2.1.4 不同种生长素(IAA、IBA、NAA)对组培苗生长及生根的影响第24页
        2.1.5 不同的蔗糖浓度对组培苗生长及生根的影响第24页
        2.1.6 不同接种材料对组培苗生根及生长的影响第24页
        2.1.7 加入活性炭(Vc)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对组培苗生长及生根的影响第24-25页
    2.2 结果与分析第25-29页
        2.2.1 不同取材时间及室内培养的材料对无菌培养体系建立的影响第25页
        2.2.2 不同浓度 BAP 对初代培养芽萌动及生长的影响第25页
        2.2.3 不同的激素处理对组培苗增殖的影响第25-26页
        2.2.4 MS 中不同无机盐浓度对组培养苗生根及生长的影响第26-27页
        2.2.5 不同类型生长素(IAA、IBA、NAA)对组培苗生长及生根的影响第27-28页
        2.2.6 不同的蔗糖浓度对组培苗生长及生根的影响第28页
        2.2.7 接种不同材料对组培苗生根及生长的影响第28页
        2.2.8 加入活性炭(AC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对组培苗生根及生长的影响第28-29页
        2.2.9 ‘白河-35-1’茎尖培养体系建立第29页
    2.3 讨论第29-31页
第三章 中国华东葡萄‘白河-35-1’器官再生体系的研究第31-39页
    3.1 试验材料第31页
        3.1.1 材料第31页
        3.1.2 主要试剂第31页
        3.1.3 主要仪器第31页
    3.2 试验方法第31-33页
        3.2.1 外植体的接种方法第31页
        3.2.2 外植体的培养方法第31-32页
        3.2.3 不同外植体类型对再生的影响第32页
        3.2.4 不同基本培养基对叶片再生的影响第32页
        3.2.5 不同分裂素种类及浓度对叶片再生的影响第32页
        3.2.6 不同生长素对叶片再生的影响第32页
        3.2.7 不同的前期培养的外植体对再生的影响第32页
        3.2.8 不定芽生根诱导及移栽第32-33页
        3.2.9 叶状结构的石蜡切片制作及观察第33页
        3.2.10 结果调查与统计分析第33页
    3.3 结果与分析第33-37页
        3.3.1 外植体接种后形态变化第33页
        3.3.2 不同外植体类型对叶片再生的影响第33-34页
        3.3.3 不同基本培养基对叶片再生的影响第34页
        3.3.4 不同分裂素种类及浓度对叶片再生的影响第34-35页
        3.3.5 不同生长素对叶片再生的影响第35-36页
        3.3.6 不同的前期培养的外植体对再生的影响第36-37页
        3.3.7 叶状结构的石蜡切片观察第37页
    3.4 讨论第37-39页
第四章 中国野生葡萄胚状体途径再生研究第39-46页
    4.1 试验材料第39页
    4.2 主要试剂及仪器第39页
    4.3 试验方法第39-41页
        4.3.1 取材时间第39-40页
        4.3.2 外植体处理第40页
        4.3.3 愈伤组织的诱导第40页
        4.3.4 MSC 培养基中不同基本培养基对白河-35-2、宁强-6 雄蕊胚状体诱导的影响第40页
        4.3.5 MSC 培养基中不同凝固剂对‘白河-35-2’、‘宁强-6’雄蕊胚状体诱导的影响第40页
        4.3.6 体细胞胚的诱导第40-41页
        4.3.7 体细胞胚的萌发和成苗第41页
    4.4 结果与分析第41-44页
        4.4.1 不同种葡萄愈伤诱导率及胚状体诱导率差异第41-43页
        4.4.2 MSC 培养基中不同基本培养基对‘白河-35-2’、‘宁强-6’雄蕊胚状体诱导的影响第43-44页
        4.4.3 不同凝固剂对‘白河-35-2’、‘宁强-6’雄蕊胚状体诱导的影响第44页
    4.5 讨论第44-46页
第五章 中国野生葡萄‘白河-35-1’乙二醛氧化酶基因 VpGLOX 功能分析第46-63页
    5.1 材料与方法第46-51页
        5.1.1 材料第46-47页
        5.1.2 实验方法第47-51页
    5.2 结果与分析第51-61页
        5.2.1 干扰载体的构建第51-53页
        5.2.2 植物表达载体的构建第53-55页
        5.2.3 葡萄白粉菌接种后抗病和感病品种中 VpGLOX 的表达量变化情况第55页
        5.2.4 VpGLOX 转基因烟草的产生第55-57页
        5.2.5 VpGLOX 在烟草中过量表达增强了烟草疫病的抗性第57-58页
        5.2.6 VpGLOX 在烟草中过量表达对烟草叶片乙二醛氧化酶活性的影响第58-59页
        5.2.7 过量表达 VpGLOX 烟草干扰后对 VpGLOX 的表达影响第59-61页
    5. 3 讨论第61-63页
        5.3.1 葡萄接种白粉病后抗病和感病品种中 VpGLOX 表达的差异第61页
        5.3.2 在烟草中过量 VpGLOX 对植物抗病性的影响第61-62页
        5.3.3 关于 VpGLOX 的功能第62-63页
第六章 中国野生华东葡萄病程相关新基因 VpPR17 的克隆与功能分析第63-88页
    6.1 材料与方法第63-69页
        6.1.1 材料第63-64页
        6.1.2 试验方法第64-69页
    6.2 结果与分析第69-88页
        6.2.1 VpPR17 cDNA 全长序列的 PCR 扩增第69页
        6.2.2 VpPR17 编码蛋白的物理化学性质分析第69-77页
        6.2.3 原核表达载体以及植物表达载体的构建第77-81页
        6.2.4 VpPR17 亚细胞定位第81-82页
        6.2.5 接种后葡萄白粉菌抗病和感病品种中 VpPR17 的表达量变化情况第82-83页
        6.2.6 VpPR17 原核表达载体及表达产物的抑菌活性第83-85页
        6.2.7 ‘白河-35-1’离体叶片 VpPR17 瞬时转化对霜霉病菌丝发生的影响第85页
        6.2.8 讨论第85-88页
第七章 中国野生华东葡萄热激转录因子 VpHsf1 的克隆与功能分析第88-102页
    7.1 材料与方法第88-91页
        7.1.1 材料第88-89页
        7.1.2 试验方法第89-91页
    7.2 结果与分析第91-100页
        7.2.1 VpHsf1 全长序列的克隆及序列分析第91-95页
        7.2.2 VpHsf1 核定位功能分析第95页
        7.2.3 VpHsf1 在葡萄热激、干旱处理以及病原菌诱导前后的表达分析第95-97页
        7.2.4 VpHsf1 转基因烟草的产生第97页
        7.2.5 VpHsf1 降低了烟草的耐热性但增加了烟草的获得耐热性第97-99页
        7.2.6 VpHsf1 在烟草中的过量表增加了烟草黑胫病的敏感性第99页
        7.2.7 VpHsf1 对烟草渗透胁迫的影响第99-100页
    7.3 讨论第100-102页
第八章 结论第102-104页
参考文献第104-114页
致谢第114-115页
作者简介第115页
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