水麻叶多酚提取纯化及其抗氧化、抗癌活性研究

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水麻是一种野生的药用源植物资源,主要分布在亚洲东部和非洲北部,包括中国、不丹、印度东北部、尼泊尔、台湾和日本。水麻的叶、茎、根可以入药,具有治疗风湿肿痛的作用;水麻果实可以鲜食也可以酿制成果酒。然而,水麻这种野生植物资源尚未得到应有的重视,这不利于野生植物资源的保护及开发利用。水麻叶和果实均含有丰富的功能性成分,其中多酚类物质是主要的活性成分,具有抑菌、抗氧化和抗癌等作用,但其抗氧化及抗癌机理并不明确。为此,本研究选用水麻叶作为试验材料,从水麻叶中提取并纯化多酚,分析多酚组成,再测定水麻叶多酚粗提物及纯化物的抗氧化能力,最后探索水麻叶多酚的抗癌活性并进一步明确其抗癌活性的分子机制。本研究采用超声辅助提取法提取水麻叶多酚并优化提取参数;使用大孔树脂纯化水麻叶多酚并优化相关参数;利用高相液相色谱法分析水麻叶多酚成分;用分光光度法测定水麻叶多酚的总还原力、清除OH·、清除DPPH·和ABTS·的能力;采用细胞体外试验,选取处于对数生长期且状态良好的人非小肺癌A549细胞和人宫颈癌Hela细胞作为试验对象,以水麻叶多酚纯化物为受试物,采用MTT法检测水麻叶多酚对细胞存活率的影响;Hoechst 33258染色,倒置荧光显微镜观察水麻叶多酚对细胞形态的影响;利用流式细胞仪检测分析A549和Hela细胞经受试物处理后的细胞周期分布、凋亡情况、细胞中活性氧水平变化以及线粒体膜电位的变化情况;采用Western Blot免疫蛋白印迹法测定凋亡相关蛋白P53、Bcl-2/Bax、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-c、PARP的蛋白表达量。主要研究结果如下:(1)经过单因素试验和正交试验得水麻叶多酚最优提取工艺为:甲醇浓度为70%,超声功率为100w,提取温度为70℃,提取时间为50min,在此最优提取工艺下水麻叶多酚得率为10.88%。(2)优化后的大孔树脂吸附条件为:选择LSA-5B大孔树脂,上样液中多酚浓度为1.5 mg/mL;处理量3.6 BV,pH值3.5,上样流速为3 BV/h(1.5 mL/min),温度为25℃。洗脱条件如下:70%乙醇溶液(V/V)作为洗脱剂,洗脱流速3 BV/h,洗脱用量7 BV。最终纯化产物的总多酚含量为75.36 mg/100mg。(3)抗氧化活性测定结果表明,水麻叶多酚具有较强的抗氧化活性,其总还原力、清除DPPH·和ABTS·能力均强于维生素C。在总酚浓度相同条件下,水麻叶多酚粗提物和纯化物的总还原力和清除自由基的能力相当,说明多酚是水麻叶提取物具有抗氧化作用的主要原因,而且纯化步骤不影响主要活性成分的含量。(4)使用HPLC分析了水麻叶多酚中的10种单体酚,可能是以下物质:1、没食子酸;2、原儿茶酸;3、表没食子儿茶素;4、儿茶素;5、咖啡因;6、绿原酸;7、表没食子儿茶素没食子酸酯;8、表儿茶素;9、没食子儿茶素没食子酸酯;10、表儿茶素没食子酸酯。其中绿原酸、咖啡因、原儿茶酸、表没食子儿茶素和表儿茶素含量最高,分别为22.67、15.80、10.13、7.60和6.04 mg/100mg。(5)本研究表明,水麻叶多酚能明显抑制A549、Hela细胞的增殖,并以剂量依赖的方式将A549细胞的周期阻滞在G2/M期,将Hela细胞的周期阻滞在S期。经水麻叶多酚处理后,A549、Hela细胞内活性氧水平显著上升,线立体膜电位下降,肿瘤抑制蛋白p53的表达量升高,促凋亡蛋白Bax与抑凋亡蛋白Bcl-2表达量的比值显著升高,凋亡相关蛋白Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3的表达量显著增加,细胞内的DNA修复酶PARP剪切产物的表达量升高。由此可知,水麻叶多酚可诱导A549、Hela细胞凋亡,其作用机制可能是其参与了细胞内线粒体凋亡通路。本研究较系统的研究了水麻叶多酚的提取、分离纯化、成分分析、抗氧化活性、抗癌活性及其作用机制,对充分发掘水麻叶多酚的药用保健价值具有重要意义,为水麻资源的进一步研究和开发利用提供了一定的理论基础和技术支持。
摘要第3-5页
Abstract第5-6页
第1章 文献综述第12-20页
    1.1 水麻(Debregeasia edulis)研究现状第12-13页
        1.1.1 水麻分布简介第12页
        1.1.2 水麻生物学简介第12页
        1.1.3 水麻的化学成分第12-13页
    1.2 植物多酚第13-14页
        1.2.1 植物多酚的提取方法第14页
        1.2.2 植物多酚的分离纯化第14页
    1.3 自由基与抗氧化第14-16页
        1.3.1 自由基的生成及危害第14-15页
        1.3.2 抗氧化剂第15页
        1.3.3 抗氧化活性的评价方法第15-16页
    1.4 肿瘤与细胞凋亡第16-18页
        1.4.1 肺癌研究现状第16-17页
        1.4.2 宫颈癌研究现状第17-18页
        1.4.3 细胞凋亡第18页
    1.5 本研究目的和意义第18-20页
第2章 水麻叶多酚提取、纯化工艺优化第20-38页
    2.1 试验材料和试剂第20-22页
        2.1.1 试验材料和主要试剂第20-21页
        2.1.2 主要仪器和设备第21-22页
    2.2 试验方法第22-26页
        2.2.1 总酚含量测定第22-23页
        2.2.2 单因素试验第23页
        2.2.3 正交试验第23-24页
        2.2.4 筛选大孔树脂第24页
        2.2.5 静态吸附等温线第24-25页
        2.2.6 大孔树脂静态吸附和静态解吸附试验第25页
        2.2.7 样品pH值对LSA-5B和D160树脂吸附率的影响第25页
        2.2.8 样品浓度对LSA-5B树脂吸附率的影响第25-26页
        2.2.9 流速对LSA-5B树脂吸附和解吸附能力的影响第26页
        2.2.10 最佳条件下纯化产物的制备第26页
    2.3 结果与讨论第26-36页
        2.3.1 单因素实验结果第26-28页
        2.3.2 正交试验结果第28-29页
        2.3.3 筛选大孔吸附树脂第29-31页
        2.3.4 LSA-5B和D160树脂的静态吸附和解吸动力学第31-32页
        2.3.5 静态吸附等温线第32-34页
        2.3.6 初始溶液pH值对吸容量的影响第34页
        2.3.7 水麻叶多酚在LSA-5B树脂上的动态吸附和解吸附动力学第34-36页
    2.4 本章小结第36-38页
第3章 水麻叶多酚体外抗氧化活性作用及其成分分析第38-50页
    3.1 材料、试剂与仪器第39-41页
        3.1.1 试验材料与试剂第39-40页
        3.1.2 主要仪器设备第40-41页
    3.2 试验方法第41-43页
        3.2.1 水麻叶多酚、绿茶多酚提取及纯化第41页
        3.2.2 总还原力的测定第41页
        3.2.3 清除羟基自由基能力第41-42页
        3.2.4 清除超氧阴离子自由基能力第42页
        3.2.5 清除DPPH·自由基能力第42页
        3.2.6 清除ABTS自由基能力第42-43页
        3.2.7 高效液相色谱法分析水麻叶、绿茶多酚成分第43页
    3.3 结果与分析第43-48页
        3.3.2 总还原能力测定结果第43-44页
        3.3.3 DPPH自由基清除实验结果第44页
        3.3.4 羟基自由基清除结果第44-45页
        3.3.5 超氧阴离子清除试验结果第45页
        3.3.6 ABTS自由基清除实验结果第45-46页
        3.3.7 水麻叶多酚成分及含量第46-48页
    3.4 讨论第48-49页
    3.5 本章小结第49-50页
第4章 水麻叶多酚诱导肺癌、宫颈癌细胞凋亡分子机制第50-66页
    4.1 材料、试剂和仪器第51-52页
        4.1.1 材料和试剂第51-52页
        4.1.2 主要仪器和设备第52页
    4.2 试验方法第52-55页
        4.2.1 细胞培养与分组第52-53页
        4.2.2 细胞增殖和抑制试验第53页
        4.2.3 细胞形态分析第53页
        4.2.4 用流式细胞仪(FCM)分析细胞周期第53-54页
        4.2.5 凋亡细胞分析第54页
        4.2.6 测定细胞内活性氧(ROS)第54页
        4.2.7 细胞内线粒体膜电位(△ψm)的分析第54-55页
        4.2.8 Western-blot法检测凋亡相关蛋白第55页
    4.3 结果与分析第55-63页
        4.3.1 DELPs对A549、Hela细胞活性的影响第55-56页
        4.3.2 DELPs对A549、Hela细胞形态的影响第56-57页
        4.3.3 细胞周期测定第57-58页
        4.3.4 细胞凋亡分析第58-59页
        4.3.5 ROS结果分析第59-60页
        4.3.6 △ψm的结果分析第60-61页
        4.3.7 Western Blot的结果分析第61-63页
    4.4 讨论第63-64页
    4.5 本章小结第64-66页
第5章 结论第66-68页
参考文献第68-78页
致谢第78-80页
攻读学位期间研究成果第80页
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