长白山北五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill]是我国自古以来具有药用和食用双重功能的一种草本植物资源[1]。我们早期调研发现,虽然北五味子果实已被广泛使用,但其给农民带来的经济价值还不够,导致其近几年的种植面积减少。若以北五味子采摘过程中作为废弃物的北五味子叶为原料进行开发利用,可以提高北五味子的经济价值。本实验早期研究发现,五味子叶中含有大量过氧化氢酶[25]。过氧化氢酶是一种具有消毒灭菌、漂白、保护软饮料中营养成分等作用的食品添加剂[6]。故本文拟以五味子叶为原料,采用过氧化氢酶活性为指标,提取纯化过氧化氢酶,同时确定其最佳稳定性条件,建立酶反应动力学模型,并以壳聚糖为载体固定化过氧化氢酶,为后期过氧化氢酶的广泛应用提供实验依据[78]。具体实验内容和结论如下:以过氧化氢酶活性为评价指标,考察从五味子叶提取过氧化氢酶过程中五味子叶贮存方式、料液比、提取pH、提取温度和提取时间等五个因素的最佳提取条件。筛选出三个主要因素,进一步进行Box-Behnken响应面法优化。得出最佳实验结果为:以五味子叶粉为原料,料液比为25:1,提取温度为46℃,提取pH为7.0。采用盐析沉淀法结合Sephadex G-75凝胶过滤层析法纯化五味子叶过氧化氢酶,得到最大纯化倍数达到9.69倍。通过紫外吸收光谱扫描,得到过氧化氢酶在吸光度240nm处存在吸收峰。根据SDS-PAGE电泳结果,得出过氧化氢酶的亚基分子质量为68.7kD。采用高效液相色谱法测定纯化后得到的过氧化氢酶纯度达到91.037%,过氧化氢酶的浓度约为0.219 g/mL。以过氧化氢酶相对酶活力为检测指标,考察提取pH、热稳定性、有机化合物、有机溶剂以及金属离子等五个因素对过氧化氢酶稳定性的影响。结果表明过氧化氢酶在pH为7.0时,温度在2535℃,稳定性较好。草酸、Cu2+、Mg2+对五味子叶中过氧化氢酶具有一定激活作用,甲醇、乙醇、异丙醇、酒石酸、水杨酸、麦芽糖、葡萄糖、Mn2+、Na+对五味子叶中过氧化氢酶具有一定抑制作用。通过Lineweaver-Burk法（即双倒数作图法）测定得到过氧化氢酶的米氏常数Km值为8.372 mmol/L。通过失活动力学常数Km值以及温度与失活动力学常数之间的关系得到五味子叶中过氧化氢酶的半衰期以及活化能。当温度升高至65℃时,五味子叶中过氧化氢酶的半衰期为1.37 min。过氧化氢酶活化能△E为2.135×103J/moL。以过氧化氢酶活力为指标,研究吸附时间、交联时间、交联剂用量、过氧化氢酶加入量等五个单因素对酶固定化效果的影响,筛选出三个主要因素进行响应面优化。通过响应面法优化得到固定化的最佳提取条件为:吸附时间为2 h,交联剂用量为101 mL,过氧化氢酶加入量为6 m L,过氧化氢酶活力为93.25 U/g。
